Hydrolyse de l’ester octylique de l’acide 2-bromo phényl acétique par la lipase de

par la lipase de Candida rugosa

La lipase de C. rugosa (CRL) a également été étudiée pour la résolution de l’ester octylique de l’acide 2-bromo phényl acétique en diphasique phase aqueuse/CO2SC en comparaison avec le système diphasique phase aqueuse/décane comme précédemment avec la lipase de Y. lipolytica. Ce système avait déjà été validé en tube Eppendorf dans la littérature en utilisant les isoenzymes sécrétées par Y. lipolytica (CRL1, CRL3 et CRL4 de C. rugosa, utilisant comme système d’expression Y. lipolytica) (Piamtongkam et al., 2011). CRL1 possède une énantiosélectivité supérieure à 200, avec une énantiopréférence (S) comme Lip2p de Y. lipolytica. Ici nous avons utilisé le mélange commercial provenant de Fluka (3,85 U/mL) à 28 g/L qui sera utilisé, pour des raisons de gain de temps, pour éviter la culture de la levure pour la sécrétion de l’isoenzyme (cf 1.2.2). De plus pour obtenir des cinétiques de réactions comparables à celles de Lip2p V232S de Y. lipolytica à partir du surnageant de culture il faudrait le concentrer (30 fois pour CRL1 par exemple d’après nos expériences). Bien que ce soit un mélange de lipases provenant de C. rugosa le discours sera simplifié en la nommant « lipase ».

3.4.1. Influence de la pression en présence de la lipase de Candida rugosa

Les expérimentations d’influence de pression ont été effectuées, dans les mêmes conditions de concentrations et température que les expériences du paragraphe 3.3.2., la conversion obtenue à 24 h est de 15 % à 200 bar contre 50 % à 120 bar. Ainsi de la même manière que pour Lip2p de Y. lipolytica la pression a un effet négatif sur la cinétique de conversion. Compte-tenu du fonctionnement de cette lipase, très similaire à Lip2p de Y. lipolytica avec en particulier la présence d’un volet moléculaire, les hypothèses sur les raisons de l’effet négatif de la pression sont les mêmes que dans le cas de Lip2p de Y. lipolytica.

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3.4.2. Lipase de Candida rugosa vs lipase de Yarrowia lipolytica

Les activités pNPB des deux lipases sont présentées dans le Tableau 10 la concentration utilisée est de 28 g/L pour CRL et la concentration de Lip2p V232S est la concentration obtenue dans le surnageant de culture de Y. lipolytica. On observe la forte activité pNPB de la lipase commerciale CRL à cette concentration, plus de 10 fois supérieure à celle de Lip2p V232S de Y. lipolytica. Cette concentration importante (28 g/L) en CRL a été choisie pour obtenir des cinétiques proches de celles de Lip2p pour la réaction d’hydrolyse de l’ester octylique de l’acide 2-bromo phényl acétique.

La lipase de C. rugosa est comparée à Lip2p V232S de Y. lipolytica pour l’hydrolyse en système diphasique (phase aqueuse/décane et phase aqueuse/CO2SC) du substrat d’intérêt et les résultats sont présentés dans la Figure 38. En système diphasique phase aqueuse/décane, la lipase de Y. lipolytica s’est révélée plus performante, alors que c’est la lipase de C. rugosa la plus performante en système diphasique phase aqueuse/CO2SC. Rappelons tout de même que les concentrations en CRL sont très importantes par rapport à celle de Lip2p, les performances sont donc comparées dans des conditions bien spécifiques. Trois théories sont envisagées à ce stade. La première concerne le mécanisme d’ouverture du volet moléculaire de C. rugosa qui est peut-être moins impacté par une plus forte polarité du solvant CO2SC. La seconde théorie pourrait être que les carbamates formés par

l’interaction entre le CO2 et les acides aminés lysines de l’enzyme peuvent être moins

nombreux ou placés de façon moins « dérangeante » pour le positionnement du substrat dans le site actif dans le cas de CRL. La troisième hypothèse concerne la composition de la phase aqueuse, dans un cas il s’agit d’un surnageant de culture et dans l’autre d’un mélange commercial.

Tableau 10 : Activité pNPB de Lip2p de Y. lipolytica et de la lipase de C. rugosa

Le test pNPB est effectué à pH7,2 et 25 °C, en microplaque. Les activités sont données en µmol de pNP libéré par mn et mL d’enzyme

Enzyme Activité pNPB

Lip 2p V232S 10

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Figure 38 : Comparaison des performances de la lipase provenant de C. rugosa (CRL) et Lip2p V232S provenant de Y. lipolytica pour l’hydrolyse de l’ester octylique de l’acide 2-bromo phényl acétique en système diphasique Système diphasique phase aqueuse/décane et phase aqueuse/CO2SC, 33 °C 1 mol/L de sel (Na2HPO4 et

KH2PO4 pH 7), 0 ou 120 bar (décane ou CO2SC), agitateur magnétique 1600 tr/mn, dans le réacteur de 90 mL,

volumes des phases sont égaux

La réaction avec la lipase de C. rugosa a été suivie sur des temps longs (100 h) et la conversion était alors de 90 % en système diphasique phase aqueuse/CO2SC ce qui montre que de la même façon que pour la lipase de Y. lipolytica les cinétiques de réactions sont moins rapides en système diphasique phase aqueuse/CO2SC qu’en système phase

aqueuse/décane mais de fortes conversions sont néanmoins obtenues.

3.4.3. Effet de la polarité

La même expérience que celle qui a été décrite dans le paragraphe 3.3.2 a été effectuée pour mettre en évidence sur l’activité la lipase de C. rugosa (Fluka 2,8 g/L) l’effet de l’augmentation de la polarité de la phase organique en utilisant du 5-méthyl-2-hexanone (5M2H) au décane. Les résultats sont présentés sur la Figure 39.

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Figure 39 : Effet de l’augmentation de la polarité de la phase organique sur l’hydrolyse de l’ester octylique de l’acide 2- bromo phényl acétique par la lipase de C. rugosaen système diphasique phase aqueuse/décane

Le décane est mélangé avec différentes quantités de 5M2H (% en volume), seul l’énantiomère (S) est hydrolysé, 50 mM de (R, S) ester au départ, les volumes de phases sont égaux (750 µL), en tube Eppendorf (2 mL avec une agitation sur agitateur de type vortex, à température ambiante)

Contrairement à ce qui s’est produit pour Lip2p de Y. lipolytica il faut plus de 10 % de 5M2H pour réduire significativement la vitesse initiale de la réaction. De plus, alors qu’à 50 % de 5M2H la vitesse de réaction avec Lip2p est quasiment nulle, ce n’est pas le cas pour la lipase de C. rugosa, qui est toujours active lorsque la phase organique est composée uniquement de 5M2H (100 % de 5M2H). Ainsi il semble que la polarité ait moins d’effet sur la lipase de C. rugosa (si bien entendu c’est l’effet de la polarité qui prime car il est aussi possible d’envisager un effet direct de la molécule de 5M2H sur l’enzyme). Si la polarité a bien un effet sur l’ouverture du volet moléculaire alors il est possible de conclure que la polarité a moins d’effet sur l’ouverture du volet moléculaire dans le cas de cette lipase comparé à Lip2p. Cela corroborerait avec le fait que la lipase de C. rugosa montre de meilleurs résultats en CO2SC (avec les concentrations en enzyme testées). Des expérimentations

supplémentaires sont nécessaires pour valider cette théorie avec l’utilisation d’une lipase sans volet moléculaire comme par exemple une lipase issue de C. antarctica ou alors de la modélisation moléculaire pour modéliser l’ouverture du volet moléculaire dans des solvants plus ou moins polaires ou encore la formation de carbamates. Cependant, il est difficile de

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penser que l’effet négatif de la pression est dû à une augmentation de polarité du solvant car pour la lipase de C. rugosa la polarité devrait avoir beaucoup moins d’effet et l’augmentation de la polarité avec l’augmentation de la pression est mineure…