Annexes

3.3.4.1. Effet de la dialyse du surnageant de culture

Il a été envisagé que l’utilisation directe du surnageant du milieu de culture de Y. lipolytica (contenant l’enzyme Lip2p V232S) pouvait entrainer des réactions entre le CO2 et des

éléments du milieu de culture imprévues et potentiellement néfastes pour l’activité de l’enzyme. Une purification complète de la protéine était difficilement envisageable du fait des grandes quantités d’enzymes nécessaires pour les expérimentations en CO2SC. C’est

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pourquoi une dialyse a été employée pour retirer une grande partie des constituants du surnageant de culture avant son utilisation en réacteur. Après la dialyse, on constate une perte d’activité de l’enzyme d’environ 20 % (cf Tableau 9).

Tableau 9 : Effet de la dialyse du surnageant de culture sur l’activité pNPB du surnageant

Le test pNPB est effectué à pH7,2 et 25 °C, en microplaque. Les activités sont données en µmol de pNP libéré par mn et mL d’enzyme

Type de surnageant Activité pNPB (U/mL)

232S 10,5

232S dialysé 8,4

La Figure 36 présente l’effet de la dialyse sur l’hydrolyse du substrat d’intérêt par Lip2p V232S en système diphasique phase aqueuse/décane et phase aqueuse/CO2SC. L’effet de la dialyse semble négligeable dans les deux types de système, c’est pourquoi cette étape de purification n’a pas été renouvelée par la suite.

Figure 36 : Effet de la dialyse du surnageant de culture sur la réaction en système diphasique phase aqueuse/décane et phase aqueuse/CO2SC

Hydrolyse du (S) ester de l’acide octylique du 2 bromo phényl acétique par Lip2p V232S (l’énantiomère (R) n’étant pas hydrolysé par l’enzyme, 50 mM de (R, S) ester au départ), 33 °C, 0 ou 120 bar (décane ou CO2SC), 1 mol/L sels (Na2HPO4

et KH2PO4 pH 7), agitateur magnétique vitesse 1600 tr/mn, réacteur de 90 mL, les volumes de chaque phase sont égaux

3.3.4.2. Formation de carbonates

Pour pallier la baisse du pH de la phase aqueuse de fortes quantités de sels (Na2HPO4

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pouvaient former des carbonates pouvant précipiter et perturber le système (carbonates de potassium ou carbonates de sodium). Pour évaluer la possibilité d’occurrence de ce phénomène, une expérience de mise en contact d’une phase aqueuse contenant ces sels avec du CO2 pendant 4 h dans les mêmes conditions que celles de la réaction (120 bar, 33 °C)

a été réalisée dans la cellule haute pression. La précipitation de carbonates n’a pas été détectée visuellement.

3.3.4.3. Utilisation de tensio-actifs

En plus des expériences de changement de mobile d’agitation ou de changement de vitesse d’agitation (cf paragraphe 3.3.2) il a été envisagé d’utiliser des composés tensio-actifs pour augmenter l’aire interfaciale qui est un paramètre important (Saktaweewong et al., 2011).

En effet, nous avons supposé que l’aire interfaciale pouvait être différente dans les deux systèmes ce qui aurait pu expliquer les vitesses de conversion plus faibles pour le cas du système phase aqueuse/CO2SC.

Deux tensio-actifs ont été testés : le polypropylène glycol et le poly(dimethylsiloxane)- poly(éthylene oxyde).

Dans un premier temps ces deux tensio-actifs ont été testés en tube Eppendorf (2 mL) en milieu diphasique phase aqueuse/décane avec deux concentrations : 1 % et 10 % (1 % ou 10 % du volume total des deux phases à savoir, 1,5 mL). La Figure 37 présente les résultats de ces expériences.

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Figure 37 : Effet des surfactants sur l’hydrolyse du (S) ester octylique de l’acide 2-bromo phényl acétique en diphasique phase aqueuse/décane par Lip2p V232S

Réaction effectuée dans un tube Eppendorf de 2 mL, 750 µL de chaque phase, 50 mM de (R, S) ester dans la phase organique, agitateur de type vortex, température ambiante. Les surfactants testés sont le polypropylène glycol et le poly(dimethylsiloxane)-poly(éthylene oxyde)

Quelles que soient la nature et la quantité de tensio-actifs aucun effet positif n’a été constaté dans les conditions testées. En revanche, dans un tel système agité par un agitateur de type vortex l’aire interfaciale est peut-être déjà maximale sans tensio-actif, ce qui peut expliquer que seul l’effet négatif est visible. Il a été observé que le dimethylsiloxane avait un effet très négatif sur la réaction aux deux concentrations testées, ces deux concentrations étant peut-être trop élevées ou le composé lui-même n’est pas « accepté » par l’enzyme. A l’opposé les deux concentrations testées en polypropylène glycol ont un effet négatif sur les vitesses initiales de conversion de l’énantiomère hydrolysé mais la réaction est totale au bout de 24 h.

Fort de ces résultats, le polypropylène glycol à une concentration de 1 % (en volume total) a été testé en système diphasique phase aqueuse/CO2SC. Cependant, cet ajout de tensio-actif n’a pas eu d’effet positif sur la cinétiquede réaction. Ce résultat peut s’expliquer par la trop faible quantité de tensio-actif utilisée, sa nature, ou alors par le fait que l’aire interfaciale n’est pas le phénomène limitant de ce système diphasique phase aqueuse/CO2SC. Cette explication est corroborée par le fait qu’aucune des tentatives pour améliorer l’aire

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interfaciale n’a eu un effet positif sur les vitesses de réaction (ajout de tensio-actifs, changement du mobile ou de la vitesse d’agitation).

En ce qui concerne la vitesse d’agitation, comme précisé dans la publication, 1600 rpm est le maximum que peut offrir l’appareil expérimental. De plus, un mobile d’agitation à dispersion gazeuse, spécifiquement conçu pour cet appareil a été utilisé. Cependant les résultats n’ont montré aucune amélioration de la cinétique de réaction. De plus l’effet constaté de la pression sur la réaction tend à montrer que l’aire interfaciale n’est pas ou pas seulement l’explication de la différence de performances entre les deux systèmes.

L’utilisation de tensio-actifs (le di-sulfosuccinate fluoré, di-HCF4) pour obtenir une microémulsion phase aqueuse/CO2SC avait pourtant montré de bons résultats en conduisant à des cinétiques comparables avec ceux du système diphasique phase aqueuse/heptane (Holmes et al., 1998). Cependant la lipase était différente de celle qui nous utilisons (elle provenait de Chromobacterium viscosum), le tensio-actif également, et les temps de réaction testés étaient très courts (10mn). De plus aucune expérimentation sans tensio-actifs n’est présentée. Ainsi il est difficile d’émettre une opinion à ce stade sur l’intérêt d’utiliser des tensio-actifs.

En conclusion, l’hydrolyse diphasique (phase aqueuse/CO2SC) de l’ester octylique de l’acide 2-bromo phényl acétique (avec Lip2p V232S de Y. lipolytica comme catalyseur énantiosélectif) est efficace en terme de taux de conversion mais des questions subsistent pour expliquer les différences de cinétiques observées en comparaison avec le système phase aqueuse/décane. La première étape clef pour permettre l’obtention de taux de conversions intéressants était de stabiliser le pH de la phase aqueuse (la baisse de pH étant due à la formation d’acide carbonique dans la phase aqueuse lorsqu’elle est en contact avec du CO2). La solution proposée était d’utiliser de fortes concentrations en tampon phosphate.

Même après cette stabilisation effectuée des différences de cinétique subsistent (un facteur 10) et l’explication proposée est la formation de carbamates ou un effet négatif de la polarité du CO2SC dans un système diphasique phase aqueuse/CO2SC du fait de la solubilité de l’eau dans le CO2SC (1,4 g/L à 32 °C, 100 bar (Marty and Condoret, 2001; Wiebe and

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Le prochain paragraphe propose l’utilisation d’une autre lipase, la lipase de C. rugosa pour évaluer si les résultats obtenus sont propres à la lipase de Y. lipolytica ou peuvent être généralisés à d’autres lipases.