Hybridation spécifique et variation de concentration

La première série d’expériences consistait à vérifier, pour ce type de fixation et pour notre choix de séquences de bases, la spécificité de la réaction d’hybridation et de quantifier le degré de cette spécificité. Nous avons utilisé les deux sondes Thi-ARS3 et Thi-ARS5 et nous les avons hybridés par les oligonucléotides complémentaires de séquences 3* et 5*. La figure 7.2 présente l’ensemble des données collectées pour l’hybridation de macrodépots (0,5 µl) sur des surfaces de transistors. La concentration de fixation en sondes pour ces expériences est de 50 µM . Nous observons une forte spécificité pour la réaction d’hybridation. En effet, le signal de fluorescence pour la séquence hybridée par son complémentaire est 20 à 1000 fois supérieur au signal de fluorescence pour la séquence hybridée par le non complémentaire (rapport (spec)/(non spec) de la figure 7.2).

Ces résultats pour des macrodépôts de sondes ont été confirmés en utilisant des microdé- pôts. Pour les expériences dont les résultats sont présentés à la figure 7.3, nous gardons fixe la concentration en molécules sondes et nous varions la concentration en molécules cibles de 1 nM à 1 µM lors de l’hybridation. Nous observons pour l’ensemble de ces concentrations en molécules hybridantes une spécificité de 2 à 3 ordres de grandeur entre les microdépôts hybridés par leur complémentaire (séquence 5/hybridé par 5*) vis à vis des microdépôts non spécifiques (séquence 3/hybridé par 5*). Lorsque la solution d’hybridation est très concentrée (de 10 nM à 1 µM ) toutes les molécules sondes fixées vont être hybridées par leur complémentaire en excès dans la solution. Il apparaît alors une saturation schématiquement représentée par un palier sur la figure 7.3. Cette saturation disparaît pour des concentrations inférieures à 10 nM lorsqu’il y a moins de molécules cibles en solution que de molécules sondes fixées. Un calcul d’ordre de grandeur permet, à partir de cette concentration (clim= 10 nM), d’estimer la densité de molécules sondes fixées à la surface (σsondes). En supposant l’ensemble des molécules sondes d’un dépôt de surface

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Chambre hermetique et obscure (isolante de la lumière) spécialement conçue pour permettre une hybridation longue sur les échantillons de transistors sans séchage de la solution hybridante.

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Lamelles de silicum oxydées thermiquement et dont l’épaisseur d’oxyde est optimisée pour un champ local maximal à l’interface oxyde/air (dox≃100 nm).

1 2 5 Hybridation 3* seq 3 seq 5 Hybridation 5* Fluorescence (u.ab) n˚ expérience 100 1000

(spec) / (non spec)

6 3 4 10 100 1000 10000

Thi-ARS

Figure 7.2:Signaux de fluorescence (en échelle logarithmique) correspondant à l’hybridation spécifique et non spécifique dans des macrodépots sur différentes surfaces de transistors (n◦ex-

périence). Au dessus, est représenté le rapport spécifique versus non spécifique pour l’ensemble de ces dépôts. 1 10 100 1000 1 10 100 1000 10000 100000 bruit Hybridation 5* concentration d'hybridation (nM) Thi-ARS5 Fluorescence (u. ab) Thi-ARS3

Figure 7.3:Variation du signal d’hybridation en fonction de la concentration en molécules cibles hybridantes (pour une concentration fixe des sondes de 50 µM dans des microdépôts.)

0,1 1 10 100 10 100 1000 10000 100000 Fluorescence (u. ab) concentration fixation [ µM]

Thi-ARS5 hybridé par 5* (c=10nM) Thi-ARS5 hybridé par 5* (c=1nM)

Hybridation 5*

Figure 7.4:Variation du signal d’hybridation en fonction de la concentration de fixation des sondes pour des microdépôts (et pour deux concentrations d’hybridation ; c=10 nM et c=1 nM)

s ≃ (100 µm)2 hybridées par les ADN cibles de la solution (v=10 µl), nous obtenons une densité surfacique de sondes : σsondes= climvNA s ≃ 6.10 6_sondes/µm2_{= 6.10}14_sondes/cm2

Cette valeur est surestimée par rapport à la densité surfacique obtenue par quantification de fluorescence par Kumar et al [97] : σ = 2.105sondes/µm2_{. Cette surestimation semble montrer} que seulement une fraction des molécules cibles vont s’hybrider et non la totalité de la solution. Il existe une assez grande variabilité dans les signaux de fluorescence pour différents dépôts hybridés par une même concentration en molécules cibles. Ces fluctuations qui peuvent atteindre un ordre de grandeur, s’expliquent principalement du fait de variabilités importantes des propriétés des différentes surfaces de transistors (état chimique, mouillabilité, optique6) conduisant à des taux de greffage variables en sondes et des différences de lecture en fluorescence.

Nous avons aussi étudié les variations des signaux d’hybridation en fonction de la concen- tration en ADN sondes dans les dépôts. Pour ce faire, nous déposons sur une même puce des solutions de concentrations différentes en molécules sondes (de 0,1 µM à 50 µM ) et nous hybri- dons cette puce avec une concentration donnée en molécules cibles. Deux séries sont représentées à la figure 7.4. La première série a été effectuée en utilisant une concentration de 10 nM en mo- lécules cibles lors de l’hybridation. Dans ce cas, les molécules cibles de la solution d’hybridation sont en excès par rapport aux molécules sondes fixées. L’ensemble des molécules de chaque dépôt peut être hybridé par l’ADN cible et on obtient alors un signal de fluorescence proportionnel à la concentration de fixation. La variabilité entre dépôts identiques (pour une même concentration de fixation) est moins importante dans cette expérience car les dépôts sont réalisés sur une même puce. De nombreux paramètres extérieurs (structure, condition d’hybridation, mesure optique) sont identiques pour l’ensemble de ces microdépôts et les fluctuations sont alors uniquement dues à des problèmes de reproductibilité lors du dépôt. Dans la seconde série, nous utilisons une solu- tion de 1 nM en molécules cibles pour l’hybridation. Dans ce cas, il y a plus de molécules sondes dans les dépôts que de molécules hybridantes et seulement une partie des molécules de chaque dépôt va pouvoir être hybridée. Si la probabilité d’hybridation sur le dépôt est proportionnelle à la quantité de sondes, on s’attend effectivement pour cette concentration en cible à un signal de fluorescence qui est aussi proportionnel à la concentration de fixation.