Hybridation des ARN sur membrane (Northern Blot)

Les ARN ont été mis à migrer sur un gel dénaturant constitué, pour 150 ml, de 1,5 g d’agarose, 109 ml d’eau distillée stérile, 25,5 ml de formaldéhyde et 15 ml de tampon MEN 10X (MOPS 200 mmol l-1

pH 7,0, EDTA 10 mmol l-1

, acétate d'ammonium 50 mmol l-1 ). Le marqueur de taille Millenium Marker a été utilisé. Les échantillons étaient les suivants : 20 µg d’ARN totaux, 1 µg d’ARNm et 3 µg d’ARNm. A un volume de ces échantillons, 1,6 volumes de tampon de charge (mélange de 570 µl de formamide désionisé, 170 µl de formaldéhyde 37% et 150 µl de MEN 10X) ont été ajoutés. Ce mélange est dénaturé par chauffage à 65°C pendant 5 minutes puis mis dans la glace. Les échantillons ont ensuite été chargés et la migration a été réalisée en tampon MEN 1X, à 60 V pendant environ 4 heures.

Les ARN ont ensuite été transférés sur membrane Hybond N à l’aide d’un Vacuum Blotter dans du tampon SSC 20X (Standard Sodium Citrate) et liés à la membrane par irradiation sous UV. A partir des fragments amplifiés par PCR et clonés, des sondes spécifiques de 350 bases ont été produites et marquées au 32

P en utilisant le kit Megaprime DNA labelling system (Amersham). Ce kit permet de synthétiser des fragments d’ADN grâce au fragment Klenow de la DNA polymerase. Dans le milieu réactionnel, du dCTP32

est ajouté et se trouve donc incorporé dans les brins synthétisés.

L’hybridation s’est faite selon la méthode de Church (Church and Gilbert, 1984). Après une préhybridation de 1 heure à 42°C dans le tampon Church (albumine de sérum bovine 1%, EDTA 1 mmol l-1

, NaHPO4 pH 7,2 0,5 mol l-1

et 7% SDS), la sonde est ajoutée à une concentration finale de 1 million de coups par minute et par millilitre et laissée à hybrider pendant une nuit. Après un lavage rapide dans du tampon 2X SSC (Standard Sodium Citrate) pour éliminer le tampon de Church et les restes de sonde non hybridée, la membrane est lavée à 42°C pendant 15 minutes dans du tampon 2X SSC puis 15 minutes dans du tampon 1X SSC. La membrane est alors placée dans une pochette plastique scellée et l’écran recouvert d'une couche de cristaux sensibles aux émissions radioactives est exposé. Après 4 heures d’exposition, l’écran est scanné à l'aide d'un STORM Phosphor-Fluor Imager.

Afin d’étudier la structure des gènes de l’hémoglobine de Branchipolynoe symmytilida, nous avons amplifié et comparé les séquences obtenues à partir de cDNA d’une part, et d’ADN génomique d’autre part.

a- Extraction de l’ADN génomique

L’ADN génomique de Branchipolynoe symmytilida et de B. seepensis a été extrait par la méthode classique de séparation de phases par le phénol/chloroforme après digestion par la protéinase K (Sambrook et al., 1989). Brièvement, 0,5 ml de tampon PK (Tris 50 mM pH 8,0, EDTA 10 mM et SDS 1%, NaCl 100 mM) sont ajoutés au tissu (environ 0,1 g) dans un tube Eppendorf, 20 µl de protéinase K (20 mg/ml) sont ajoutés et le tout est mis à incuber pendant 6-12 heures à 55°C (jusqu’à ce que tous les tissus soient digérés). A ce mélange, on ajoute alors 500 µl de phénol tamponné pH 8,0. Après une émulsion douce par inversion, l’échantillon est centrifugé à 5000 g pendant 5 minutes. Le surnageant est prélevé est utilisé volume à volume avec un mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) puis du chloroforme seul pour précipiter les protéines et les lipides. Le dernier surnageant est prélevé et 2,5 ml d’éthanol 100 glacé sont ajoutés précipiter l'ADN à -20°C pendant une nuit. Une centrifugation à 10000g à 4°C pendant 30 minutes permet alors de culoter l’ADN génomique. Le culot est enfin lavé avec de l’éthanol 70 puis séché. Il est repris dans 20 µl de tampon TE (Tris EDTA) dans lequel il peut être conservé. Pour être utilisé dans des réactions de PCR, l’ADN est dilué au 1/20ème

et utilisé à raison de 1µl par mélange réactionnel de 50 µl.

b- Amplification du gène

A partir des séquences obtenues par amplification de l’ADNc, nous avons dessiné des amorces spécifiques des différentes globines amplifiées. Ces amorces ont été utilisées en PCR pour amplifier la séquence correspondante sur l’ADN génomique.

Mélange réactionnel : Tampon 10X 5 µl

Amorce F (10 µM) 5 µl Amorce R (10 µM) 5 µl dNTPs (10 mM) 1 µl Hot Start Taq (5U/µl) 0,25 µl H₂O distillée stérile 32,75 µl ADN matrice 1 µl

Cycles d’amplification : 1 cycle 95°C 15 minutes

95°C 1 minute 30 cycles 56°C* 45 secondes

72°C 2 minutes 1 cycle 72°C 10 minutes

* valeur approximative, dépendant des couples d’amorces utilisé.

Le produit de cette PCR a été visualisé sur gel d’agarose et la différence de taille entre l’amplifiat sur l’ADNc et l’ADN génomique a pu être estimée.

c- Localisation des introns

Le fragment amplifié a été cloné grâce au kit TOPO TA Cloning, puis séquencé comme décrit plus haut. La séquence obtenue a été alignée avec la séquence obtenue à partir de l’ADNc et la position des introns a été établie.

III.1.7. Caractéristiques spectrophotométriques des hémoglobines

Dans le but de caractériser les différentes hémoglobines de Branchipolynoe purifiées, les caractéristiques spectrophotométriques ont été déterminées pour les dérivés oxy-hémoglobine (Hb-O₂), deoxy-hémoglobine (Hb), carboxy-hémoglobine (Hb-CO), met-hémoglobine (Hi) et cyanmet-hémoglobine (Hi-CN).

La deoxy-hémoglobine a été obtenue par ajout d’un excès de dithionite de sodium (NaS₂O₄) à l’hémoglobine obtenue après purification. Le dérivé oxy-hémoglobine a été obtenu par séparation sur colonne G25 (Pharmacia) du dithionite de l’hémoglobine puis oxygénation sous UV pour empêcher la fixation de monoxyde de carbone.

Le dérivé met-hémoglobine a été obtenu par addition de 10 µl d’une solution à 10 mM de ferricyanure de potassium (K₃Fe(CN)₆) à 2 ml d’une solution d’oxy-hémoglobine d’environ 20

µM. Le dérivé cyan-met-hémoglobine a été obtenu par addition de 10 µl d’une solution à 50 mM de cyanure de potassium (KCN) à une solution de met-hémoglobine.

Le dérivé carboxy-hémoglobine a été obtenu par bullage de monoxyde de carbone (CO) dans une solution d’oxy-hémoglobine. L’affinité de l'hémoglobine pour le monoxyde de carbone étant beaucoup plus élevée que celle pour l’oxygène, le monoxyde de carbone remplace ce dernier et reste fixé.

III.3.1. Structure des hémoglobines coelomiques HbC1 et HbC2 de

Branchipolynoe spp.

La structure des hémoglobines C1 et C2 a été étudiée chez Branchipolynoe symmytilida et

B. seepensis. Les résultats sont présentés en détail pour B. symmytilida et de façon plus

succincte pour B. seepensis.