L’hélicase réplicative est chargée sur l’ADN en absence de DciA

D du cycle cellulaire bactérien sont allongées, ou si les cellules sont bloquées. Les cellules YAV201 cultivées en présence d’arabinose sont donc potentiellement réparties entre des cellules cyclantes (dont la quantité d’ADN varie de façon continue entre 1 et 2 génomes) et des cellules bloquées à l’initiation de la réplication (qui possèdent soit 1, soit 2 génomes).

4. L’hélicase réplicative est chargée sur l’ADN en absence de DciA

Un blocage spécifique de la division cellulaire qui n’affecterait pas la réplication de l’ADN pourrait nous permettre de distinguer entre cellules cyclantes ou bloquées à l’initiation de la réplication, et nous aider à déterminer la proportion relative de ces deux types de cellules dans les populations de cellules phénotypiquement [dciA]-. Nous avons utilisé la céphalexine afin de bloquer la division cellulaire après avoir vérifier que cet antibiotique n’affectait pas la réplication chez V. cholerae. Dans Escherichia

coli, la céphalexine bloque la division sans affecter la réplication. Nous avons

vérifié qu’il en était de même dans les cellules de V. cholerae. A cette fin, une culture de nuit de la souche sauvage, YAV17, a été diluée dans du milieu minimum frais (DO550 initiale de 0,1). La culture a ensuite été complémentée en céphalexine à une concentration finale de 10µg/ml et mise en culture à 30°C. Des échantillons ont été prélevés et fixés à intervalles de temps réguliers (1 génération) pendant 5 générations. Les échantillons ont ensuite été préparés pour une analyse en cytométrie. Il apparait que la quantité d’ADN par cellule double à chaque génération à partir de la deuxième génération (t2) et pendant la durée restante de l’expérience (Figure R11). La quantité d’ADN par cellule n’évolue pas entre t0 et t1, reflétant vraisemblablement le fait que les cellules ne sont pas encore sorties de la phase de latence. Néanmoins, nous concluons que la céphalexine bloque la division cellulaire sans affecter la réplication dans V. cholerae.

Des échantillons de cellules prélevés entre t0 et g8 (Figure R10) ont été incubés pendant deux temps de génération en présence de céphalexine. Dans ces conditions, les cellules cyclantes contenant initialement entre 1 et 2

Figure R11. La cephalexine bloque la division sans affecter le programme de réplication dans V. cholerae.

Une culture de nuit de cellules sauvages YAV17 a été diluée à une DO550 de 0,1 dans du milieu frais et mis en culture à 30°C en présence de cephalexine. A chaque temps de génération (60 minutes) une aliquote de cellules est prélevée. Les cellules sont fixées dans l’éthanol 70%, puis lavées deux fois dans du TE (Tris-HCl [pH 7] 10 mM, EDTA [pH 8] 1 mM), complétées de RNaseA (10 μg/ml) et d’Iodure de propidium (10 μg/ml) et incubées à 37C pendant 1h. La quantité d’ADN par cellule a été suivie pendant 5 générations (t0 a t5).

44

génomes accumuleraient entre 4 et 8 génomes par cellule alors que les cellules bloquées au stade de l’initiation de la réplication possèderaient toujours un ou deux génomes.

Les cytogrammes des cellules cultivées en absence d’arabinose entre t0 et g8 et incubées pendant 2 temps de génération avec la céphalexine sont identiques ; les cellules contiennent entre 4 et 8 génomes par cellule, reflétant la capacité de ces cellules à répliquer leur ADN sans diviser (Figure R12A, lignes 1 et 3). Les cytogrammes de cellules cultivées en présence d’arabinose puis soumises à la céphalexine évoluent constamment pendant l’expérience (Figure R12A, lignes 2 et 4). A la 3e génération, un massif de cellules contenant 2 génomes apparait. Ce massif prend en importance aux générations suivantes jusqu’à devenir majoritaire à partir de la génération g6. Un massif de cellules semblant contenir 1 génome apparait à la génération g4, mais celui-ci disparait dès la génération suivante au profit d’un massif de cellules en cours de réplication ; ces cellules contiennent entre 1 et 2 génomes. Il est important de noter que dans ces conditions, il n’y a plus de cellules à 1 génome ce qui implique que toutes les cellules non incubées avec la céphalexine dont la masse augmentait sans que la réplication initie (Figure R10A, ligne 2 et 4), étaient en réalité dans la période B du cycle de réplication.

Etant donné que les cellules YAV201 cultivées en présence d’arabinose sont déplétées en DciA après 3 générations, nous concluons que de l’ADN est synthétisé en absence de DciA. Dans ces cellules, la période B augmente, conduisant à une augmentation de la masse régulière des cellules (Figure R10B, milieu). Par ailleurs, la distribution de masse des cellules à 1 génome augmente également avec le temps d’incubation des cellules en arabinose (Figure R10B, bas), ce qui indique que la masse à l’initiation est devenue hétérogène dans les cellules [dciA]-. Ceci se matérialise par l’accumulation de cellules contenant 2 et 4 génomes lorsque celles-ci ont été incubées en présence de céphalexine (ces cellules proviennent respectivement des cellules à 1 et à 2 génomes dans les échantillons non incubés avec la céphalexine (Figure R12A).

Figure R12. Les cellules dciA- peuvent répliquer leur génome. A - Une culture de la souche

YAV201 en phase exponentielle de croissance (t0) réalisée à 30°C en milieu minimum-fructose est fractionnée en deux. Dans l’une des fractions, de l’arabinose est ajouté à une concentration de 0,02 % final (+ara) tandis que l’autre fraction est laissée en l’état. A chaque génération après t0 (65 minutes), chaque fraction est diluée de moitié afin de maintenir les cellules en phase exponentielle continue de croissance. Des aliquotes de cellules sont prélevées à chaque génération puis incubées pendant 2 temps de génération (soit 130 min) avec de la cephalexine (10 μg/ml final) afin de bloquer la division cellulaire et suivre l’évolution de la quantité d’ADN pendant cette période. Les populations de cellules sont ensuite analysées par cytométrie en flux. B – La quantité d’ADN totale correspondant à chaque génération et condition a été mesurée et reportée pour les 2 conditions YAV201 (- ara) et YAV201 (+ ara). Le rapport entre la quantité mesurée après incubation avec la céphalexine (+ cep, en rouge) et celle mesurée avant (- cep, en bleu) est représenté (ligne pointillée, en mauve).

Nous avons évalué la quantité d’ADN totale synthétisée avant et après incubation des cellules en céphalexine au cours des 8 générations et dans chaque condition analysée. Le rapport entre la quantité mesurée après incubation avec la céphalexine et celle mesurée avant, décroit lorsque DciA est déplétée (Figure R12B).

La synthèse d’ADN étant dépendante de la translocation de l’hélicase en amont de la fourche de réplication, nous concluons également de cette série d’expérience que l’hélicase réplicative est chargée sur l’ADN en absence de DciA. Il n’est pas possible, pourtant, de déterminer si l’hélicase s’est chargée à l’origine de réplication. Afin de répondre à cette question, nous avons combiné une analyse de la fréquence des marqueurs de la réplication (MFA) (Figure R17 et R18) et une immunoprécipitation de chromatine associée à DnaB sur des cultures de la souche YAV201 cultivée en absence ou en présence d’arabinose, ainsi que sur la souche YAV420 (isogénique à YAV201 mais non délétable du gène dciA) cultivée en présence d’arabinose (Figure R16).

5. Accumulation de l’hélicase réplicative sur quelques loci