Caractérisation initiale d’un mutant dciA

Nous avons donc modifié notre protocole expérimental de façon à analyser les cellules phénotypiquement [dciA]- et ce afin d’analyser l’impact de la perte de la protéine DciA sur la synthèse d’ADN en général par cytométrie de flux, et le recrutement de l’hélicase réplicative sur l’ADN par immunoprécipitation de Chromatine (ChIP). En parallèle, nous avons suivi en « time-lapse » l’évolution de cellules déplétées de dciA. Afin d’effectuer ces analyses sur un grand nombre de générations et pour éviter l’entrée des cellules en phase stationnaire, nous les avons maintenues en phase exponentielle continue de croissance en diluant de moitié les cultures à chaque génération.

Dans l’optique d’analyser le recrutement de l’hélicase sur l’ADN, nous avons construit la souche YAV201 et mené le reste de nos expériences sur cette souche. Nous avons suivi la souche YAV201 cultivée en milieu minimum à 30°C en présence d’arabinose au cours de 8 générations. En guise de témoin, nous avons inclus dans l’analyse la même souche cultivée en absence d’arabinose ainsi qu’une souche isogénique, sauvage pour dciA (YAV420) (Figure R4) en présence d’arabinose. Le suivi de croissance a été assuré par la mesure de la densité optique (OD550) pendant tout le temps de l’expérience (Figure R10B, haut).

En absence d’arabinose (Figure R8A, i.e., en conditions de non déplétion de DciA), on observe une prolifération normale des cellules caractérisée par un cycle cellulaire typique de V. cholerae. La réplication est initiée dans des cellules de taille homogène contenant une seule oriC1 localisée au vieux pôle. Suivant la duplication rapide d’oriC1, l’une des copies est envoyée vers le nouveau pôle. Finalement, la division sépare cette cellule en deux parties égales (les flèches vertes et le trait blanc illustrent la dynamique d’oriC1 et la division d’une cellule au cours d’un cycle (David et al, 2014). Après incubation avec de l’arabinose (Figure R8B et R8C, i.e., en conditions de déplétion de DciA), les cellules prolifèrent de façon anormale. On observe des divisions donnant naissance à des cellules dans lesquelles aucun signal de fluorescence correspondant à oriC1 n’est visible (Figure R8B,

Figure R7. Cinétique de déplétion de la protéine DciA après délétion du gène dciA. Une culture de la souche YAV380 en phase exponentielle de croissance (milieu minimum, 30°C) est fractionnée en deux. Dans l’une des fractions, de l’arabinose est ajouté (0,02 % final) pour induire la délétion du gène de fusion dciA-3xFLAG (+). Dans l’autre fraction, l’arabinose n’est pas ajouté (-). Des aliquotes de cellules dans chacune des fractions sont prélevées toutes les générations pendant six générations et analysées par western blot pour détecter la protéine de fusion DciA-3xFLAG. A- Les cellules sont lysées en tampon de Laemmli (2% SDS, 10% glycérol, 0,002% bleu de bromophénol, 0,0625M Tris-HCl [pH8], 5% β-mercaptoéthanol) incubées à 95°C. et les lysats obtenus sont mis à migrer sur gel dénaturant SDS-PAGE 15%. Les protéines sont ensuite transférées sur membrane de nitrocellulose et la protéine DciA-3xFLAG révélée à l’aide d’anticorps dirigés contre l’épitope 3xFLAG. Les aliquotes analysées à chaque génération (1 à 6) et pour chaque condition (- et +) sont présentés. Une aliquote de la culture YAV380 en phase exponentielle de croissance marquant le début de l’expérience (t0) est aussi analysée. B- Les bandes de protéines DciA-3xFLAG ont été quantifiées à l’aide du logiciel BioRad Lab-Software-6.0.1 et rapportée chacune à la quantité de protéine déterminée en début d’expérience (t0) pour déterminée la fraction restante de protéine détectée à chaque génération. L’évolution de cette fraction est représentée au cours des générations pour chacune des conditions de l’expérience (-ara et +ara). PM : Marqueurs de tailles moléculaire ; kDa : KiloDalton.

Figure R8. L’initiation de la réplication est boulversée dans un mutant dciA-. Vidéo-microscopie de cellules YAV37 (LoxP[dciA], cre, ori1-lacO, lacI-mCherry) cultivées sur milieu solide M9 Fructose à 30°C après croissance en milieu M9 liquide en absence (A) ou en présence (B et C) d’arabinose (3h à 0.02% final). Images prises à 15 minutes d’intervalle. Le panel supérieur de chaque lignée correspond à la superposition entre le signal de fluorescence vert et le contraste de phase rouge. Le signal fluorescent en vert indique la position de l’origine de réplication du chromosome I de V. cholerae (ori1). Le panel inférieur correspond uniquement au contraste de phase.

Figure R9. La déplétion de DciA induit de la filamentation. Photos de micro-colonies de cellules

YAV20 cultivées 16h sur M9 fructose solide après culture en M9 liquide 16h sans (A) et avec (B) arabinose à 0.02% final.

cellules marquées par un astérisque) et par une hétérogénéité des événements de prolifération : la duplication d’oriC1 est observée à des temps très variables après division, et des tailles de cellules très différentes ; la division de la cellule est observée à des temps et des tailles très variables et pas excentrée dans la cellule. On ne peut plus décrire un cycle cellulaire, il n’y a plus de coordination entre la duplication d’oriC1 et la division cellulaire. Les cellules ont été cultivées sur une plus longue période (Figure R9). Sans déplétion de DciA (Figure R9A), la microcolonie formée à partir d’une cellule unique est circulaire et est constituée de cellules de taille homogène. Par contre, après une déplétion de DciA de longue durée (Figure R9B), la prolifération cellulaire conduit à la formation de microcolonies hétérogène constituées de taille très hétérogène, allant d’une taille normale à hyper-filamenteuse.

Le profil de cytométrie des cellules YAV201 cultivées en absence d’arabinose (Figure R10A, lignes 1 et 3) ainsi que celui des cellules YAV420 cultivées en présence d’arabinose (données non montrées pour YAV420) reste inchangé pendant toute la durée de l’expérience, indiquant que les cellules cyclent normalement. A l’inverse, le profil de cytométrie des cellules YAV201 cultivées en présence d’arabinose a évolué significativement au cours de l’expérience (Figure R10A, ligne 2 et 4). Durant les trois premières générations (g1 à g3), peu de différences sont notées avec les profils de cytométrie reportant l’évolution de la masse en fonction de la quantité d’ADN obtenus des mêmes cellules cultivées en absence d’arabinose. A partir de la 4e génération, les cellules contenant 1 ou 2 génomes deviennent majoritaires tandis que la quantité de cellules cyclantes (c.-à-d. situées entre celles à 1 et celles à 2 génomes) diminue ; les cellules contenant 1 ou 2 génomes forment 2 massifs distincts (Figure R10A). Dans ces échantillons, la masse moyenne sur l’ensemble de la population analysée (Figure R10B, milieu) ainsi que la distribution des individus autour de la masse moyenne des cellules contenant 1 génome augmente sans cesse avec le nombre de générations (Figure R10B,

bas). A ce stade, il est difficile de déterminer si ces populations de cellules

Figure R10. La déplétion de DciA affecte l’initiation de la réplication. A- Une culture de la souche

YAV201 en phase exponentielle de croissance (t0) réalisée à 30°C en milieu minimum-fructose (annexes) est fractionnée en deux. Dans l’une des fractions, de l’arabinose est ajouté à une concentration de 0,02 % final (+ara) tandis que l’autre fraction est laissée en l’état. A chaque génération après t0 (65 minutes), chaque fraction est diluée de moitié afin de maintenir les cellules en phase exponentielle continue de croissance. En parallèle, une aliquote est prise à chaque temps pour être analysée par cytométrie en flux. Les cytogrammes représentent l’évolution de la masse (ordonnée) en fonction de la quantité d’ADN présente dans la cellule (abscisse). Ceux-ci sont donnés pour chaque fraction (+ara, ligne 1 et 3 et sans ara, ligne 2 et 4), au cours des 8 générations successives (g1 à g8). Le cytogramme des cellules à t0 est aussi présenté. B – (haut) La croissance des cultures incubées en présence d’arabinose (ligne pointillée rouge) ou non (ligne pointillée bleue) est mesurée par la densité optique (OD550). (milieu) La masse moyenne des cellules déplétées ou non de DciA a été calculée à chaque génération. Cette masse a été calculée sur l’ensemble des cellules présentes dans les cytogrammes. (bas) La variance autour de la moyenne a été estimée en fonction de