construction d’un dendrogramme par analyse algorithmique UPGMA.
Les groupements phylogénétiques des souches de référence établis par notre étude sur la base des 4 endonucléases ; Msp I, Hinf I, Hha I et Taq I sont représentées par la figure 29.
A 75%, on obtient quatre clusters et un linéage indépendant formé par la souche
Allorhizobium undicola. Le premier cluster (A) regroupe les souches des deux genres Rhizobium et Agrobacterium; le deuxième cluster (B) regroupe les souches de Mesorhizobium; le troisième cluster (C) regroupe les souches de Sinorhizobium et le
quatrième cluster (D) est représenté par les souches de Bradyrhizobium.
Les groupements des souches de référence obtenus dans notre étude sont en parfait accord avec ceux obtenus par Laguerre et al. (1994) en utilisant l’ARDRA sur la base de 9 enzymes de restriction. En fait, ces mêmes auteurs ont rapporté qu’un minimum de 4 enzymes peut être utilisable pour une bonne discrimination entre les souches de rhizobia. En effet, les 4 enzymes utilisés, Msp I, Hinf I, Hha I et Taq I, donnent des profils à haut niveau de différenciation entre les souches les plus éloignées et figurent parmi celles les plus couramment utilisées dans l’étude de taxonomie des rhizobia (Laguerre et al., 1994 ; Neyra et al., 1998).
La classification des souches de référence étudiées reflète la classification établie sur la base de l’ARDRA par plusieurs autres études (Laguerre et al., 1994 ; 1997 ; Khbaya et al., 1998). En effet, par notre étude, nous avons également pu noter que les deux souches S. meliloti et S.
fredii sont groupées ensemble. Le cluster 1 indique que les souches de Rhizobium et celles
d’Agrobacterium sont entre-mélangées. En outre, A. rhizogenes est classé avec les différentes souches de Rhizobium leguminosarum et A. tumefaciens est proche de R. galegae. Cependant, selon Laguerre et al. (1997), les deux souches S. terangae et S. saheli présentent 100% de similitude. Dans notre cas, ces souches montrent un niveau de divergence de 0,5% seulement. Le groupement général de l’ensemble des souches de référence reflète également la classification établie sur la base de la séquence complète de l’ADNr 16S (Terefework et al., 2001 ; Sawada et al., 2003 ; van Berkum et Fuhrmann, 2000). Dans notre cas, nous avons également pu mettre en évidence le regroupement de S. kostiense avec S. terrangae et de M.
% of similarity
Br.sp.ArachisISRA616 Br.sp.ArachisISRA601 Br.elkanii Br. japonicum Br. canariense All. undicola S. kostiense S. saheli S. terangae S. medicae S. fredii S. meliloti S. arboris M. loti M. ciceri M. plurifarium M. huakuii M. mediterraneum M. tianshanense Ag. vitis Rh.huautlense Rh. gallicum Ag. rubi Ag. tumefaciense Rh. mongolensis Rh. galegae Rh. etli Rh. giardinii Ag. rhizogene Rh.leg.bv.phaseoli Rh.leg.bv.trifolii Rh.leg.bv.viciae100
90
80
70
60
50
Rhizobium & A g robacterium M esorhizobium Brad yrhizob ium Al lorhizobium Sino rhi zobium D C A BFigure 29 : Dendrogramme construit par UPGMA indiquant la position phylogénétique des souches de référence utilisées sur la base de la PCR/RFLP de l’ADNr 16S
Les groupements phylogénétiques combinant aussi bien les souches de lupin que les souches de référence sont représentés par la figure 30. Concernant les souches de lupin, à au niveau de similarité de 70%, elles se répartissent en cinq groupes distincts. Si on se situe à un niveau de similarité de 80%, on remarque que chacun des clusters 2, 3, 4 et 5 se trouve subdivisé en 3 à 4 sub-clusters indiquant ainsi la grande diversité génétique qui existe entre ces souches. En comparant avec les souches de référence, nous avons noté que trois souches seulement de lupin ont un niveau de similitude élevé avec les souches de référence. Il s’agit de la souche INRA L 61 qui forme un même et unique linéage avec R. leguminosarum bv. viciae et R.
leguminosarum bv. Trifolii ; la souche INRA L 23 rapprochée de R giardinii avec un
coefficient de similitude de 88%, et enfin, la souche INRA L 29 rapprochée des souches de
Mesorhizobium avec toutefois un niveau de divergence de 25%.
Les souches du cluster 1 forment, à un niveau de similarité de 75%, un même groupe avec les différentes souches de Rhizobium et d’Agrobacterium.
Le groupe de souches formé par les clusters 2, 3 et 4 se trouve rapproché au groupe de souches de référence appartenant aux genres Rhizobium, .Mesorhizobium et Sinorhizobium à un niveau de similitude de 62% qui correspond à la troisième subdivision de l’arbre phylogénétique.
Le cluster 5 est formé par 11 souches de l’amas nodulaire. En fait, ces souches forment une branche séparée dans l’arbre phylogénétique et sont classées distinctement de la totalité des souches analysées dés la première subdivision de l’arbre qui se situe à un niveau inférieur à 55% de similitude.
A travers les groupements phylogénétiques, un grand niveau de polymorphisme moléculaire a été détecté au sein des souches nodulant les six espèces de lupin et entre ces souches et les souches de référence utilisées. Toutefois, la grande diversité obtenue entre les souches nodulant le lupin ne présente aucune relation avec la plante hôte d’origine puisqu’on retrouve des souches nodulant la même espèce dans différents clusters (ex. Lupinus luteus). Cette diversité est également indépendante de la région d’origine puisque les souches issues de la même région, par exemple du Gharb ou de Rabat, se trouvent réparties dans les différents clusters délimités. Ceci, à l’exception des souches de l’amas nodulaire qui ont été isolées de l’espèce L. luteus dans la région de Mnasra et qui constituent par leur positionnement distinct un cas bien particulier (Tableau 21).