De la gonade indifférenciée à la mise en place de l’ovaire a) Phase initiale de développement ou stade indifférencié a) Phase initiale de développement ou stade indifférencié

Chez les mammifères, la mise en place des gonades débute par la formation de la crête génitale (ou gonade bi-potentielle) qui se développe à partir du système uro-génital. La crête génitale contient les futures cellules somatiques de la gonade (187) : les futures cellules de la granulosa ou de Sertoli. Plusieurs facteurs sont nécessaires à la formation des gonades chez la souris, comme les FT WT1, LHX9, CBX2 et NR5A1, spécifiquement exprimés dans la crête génitale (188, 189). En effet, chez l’être humain, des mutations de ces FT sont associées à un phénotype de réversion sexuelle (individus XY avec phénotype féminin pour les gonades).

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70 Figure 11 : Représentation schématique des principaux gènes impliqués dans la différenciation

sexuelle (adaptée de Edson et Nagaraja).

Les gènes impliqués dans la différenciation femelle (panel de gauche) et mâle (panel de droite) constituent deux réseaux de régulation mutuellement exclusifs.

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Ce phénotype est soit associé à un rôle dans la formation des gonades soit à un rôle dans la régulation de l’expression de NR5A1 (190), nécessaire à l’expression des gènes essentiels dans la mise en place du sexe masculin. D’ailleurs son expression est maintenue dans le développement du testicule alors que son niveau reste faible dans l’ovaire.

b) Déterminisme du sexe et différenciation ovarienne

Le dimorphisme sexuel est le résultat d’activation de réseaux de régulations différents et incompatibles qui jouent un rôle propre au sexe de l’individu. Le sexe génétique (XX ou XY) détermine alors le sexe gonadique. Chez l’individu XY, le FT SRY (Sex determining region of the Y), est exprimé sous l’influence notamment de SF1, WT1. SRY et NR5A1 initient alors ensemble le programme de différenciation mâle, via une activation de SOX9, régulant lui-même plusieurs gènes essentiels au développement des testicules et des caractères secondaires mâles, tels l’AMH, FGF9 ou

DHH (191–193). Chez la souris, SOX9 seul est nécessaire et suffisant à la détermination sexuelle mâle,

SRY participant, tout de même, à son activation temporelle précise (192). Chez l’individu XX, c’est la simple absence de SRY qui entraine le développement d’un ovaire (Figure 11).

Les principaux gènes nécessaires à la formation de la gonade femelle font partie de la voie β-caténine (WNT4, RSPO1 et la β-β-caténine elle-même). Cette voie active l’expression de la follistatine (FST), un inhibiteur de la voie TGF-β, nécessaire à la formation de l’ovaire. En effet, dans les souris femelles, l’inactivation du gène Fst est associée à un développement de structures typiques du testicule dans les gonades (194). D’autres facteurs comme Bmp2 et Foxl2 qui sont exprimés au début du développement de l’ovaire pourraient jouer un rôle. FOXL2 est le marqueur de l’ovaire dont l’expression spécifique est la plus précoce connue à ce jour, dès 12,5 jpc. Cependant, les souris

Foxl2-/- présentent un développement normal jusqu’à la naissance (116, 195). Il est intéressant d’ajouter

que l’inactivation de la β-caténine dans des cellules NR5A1-positives est associée à une perte d’expression de Foxl2 et Wnt4, signifiant donc un arrêt de la voie de différenciation femelle.

En plus de promouvoir l’expression de gènes spécifiques à chaque sexe, les voies β -caténine et SOX9 se répriment mutuellement, rendant les deux réseaux de régulation incompatibles (Figure 11) (187, 196).

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72 Figure 12 : Phénotype gonadique de l’invalidation de Foxl2 induite à l’âge adulte chez la souris

(d’après Ulhenhaut et al., 2009) en vis-à-vis des structures testiculaires.

Panel de gauche, coupe ovarienne puis grossissement sur un ovocyte issu de femelle X/X WT. Panel central, invalidation de Foxl2 à l’âge adulte conduit à une transdifférenciation de l’ovaire. La gonade invalidée contient des structures qui ressemblent à des tubes séminifères. Les cellules de la granulosa sont transdifférenciées en cellules de « type-Sertoli », avec prolongements cytoplasmiques (astérisque) et nucléole tripartite (flèche blanche). Les structures en tubes sont entourées d’une lame basale (flèche noire). En panel de droite, une coupe de testicule puis un grossissement sur les cellules de Sertoli.

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c) Maintien de l’identité ovarienne

Une fois déterminés, les types cellulaires ne sont pas fixés et restent sous le contrôle de facteurs spécifiques, empêchant ainsi une transdifférentiation (Figure 11). Pour l’ovaire, et particulièrement dans les cellules de la granulosa, FOXL2 permet ce maintien de l’identité cellulaire. L’inactivation de Foxl2 dans des cellules de la granulosa différenciées conduit d’ailleurs à une expression de marqueurs spécifiques des cellules de Sertoli et à l’apparition de structures ressemblant aux tubes séminifères du testicule dans l’ovaire (117) (Figure 12).

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74 Figure 13 : Phénotypes morphologiques des ovaires de souris sauvage ou double KO pour les deux

récepteurs aux oestrogènes, Esr1 et Esr2 (αβERKO) (adaptée de Couse et al., 1999).

Les ovaires du contrôle pré-pubertaire [(A), grossissement, ×13.2] et les femelles αβERKO [(B), ×13.2 et (C), ×33] illustrent la maturation précoce de l'ovaire αβERKO comme en témoignent les multiples gros follicules antraux [indiqués par des astérisques en (C)], qui ne sont pas observés dans le contrôle.

Un grossissement à faible puissance d'un ovaire adulte représentatif (2,5 à 7 mois) αβERKO (D et E) illustre les diverses structures présentes, notamment les follicules relativement sains et en cours de maturation et les follicules « sertoli-like » qui occupent une grande partie de la gonade. Le grossissement d'un follicule sain dans un ovaire adulte αβERKO [(F), ×66] montre un seul ovocyte (Oc), plusieurs couches de cellules de granulosa (Gc), et une lamelle basale et un thécum intacts (Tc). Le grossissement d'une zone de follicule « sertoli-like »[(G), ×66 et (H), ×330] montre que l'ovocyte a dégénéré et que les cellules somatiques ont subi une transdifférenciation vers un phénotype de cellules de Sertoli (Sc). La préservation de la lame basale (BL) du follicule explique l'aspect tubulaire des cordes du testicule. Les cellules de type Sertoli possèdent un nucléole triparti caractéristique et des extensions cytoplasmiques en forme de voile (H) similaire au phénotype observé en KD Foxl2. Barre d'échelle en (C) à (E), (G) et (J), 100 μm ; barre d'échelle en (H) et (K), 10 μm).

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Le même phénotype est observé dans des souris KO pour les deux récepteurs aux œstrogènes,

Esr1 et Esr2 (197, 198) (Figures 13). De la même façon chez la souris, la délétion de Smad3 provoque

un arrêt de croissance au stade du follicule préantral et une diminution de la prolifération et de la survie des cellules de la granulosa (199). Ces observations laissent envisager un contrôle complexe dans le maintien de cette identité cellulaire.

d) Assemblage des follicules

La formation des follicules primordiaux résulte d’un dialogue entre les cellules germinales et somatiques. En effet si la différenciation et la maintien des cellules de la granulosa ne perdurent pas les cellules germinales (CG) meurent (117). Et inversement, la perte de CG après la formation des follicules entraîne une transdifférenciation des cellules de la granulosa en cellules de « Sertoli-like » (194, 200). Enfin, chez le rat, l’entrée en méiose de l’ovocyte a été montré comme jouant un rôle prépondérant : si elle est retardée, il y a un décalage dans la formation des follicules et inversement, si elle est plus précoce, les follicules primordiaux se forment plus rapidement (201).

Chez la souris, les CG entrent en méiose et la prophase I se déroule entre 13,5 et 15,5 jpc. A la naissance, les ovocytes sont groupés en amas et à 3 jours plus tard plus de 80% des ovocytes sont déjà intégrés dans des follicules primordiaux (202). Les facteurs paracrines sécrétés par les ovocytes et les cellules de la granulosa en différenciation aident à l’assemblage des follicules. Les ovocytes activent la formation des follicules dès qu’ils arrivent au stade diplotène de première division de méiose. Cette étape est caractérisée par une baisse de l’expression de Sycp1 juste avant l’assemblage des follicules primordiaux (201) et l’expression du FT Folliculogenesis Specific Basic Helix-Loop-Helix (FIGLA). D’ailleurs, chez la souris, lorsque ce FT est muté, aucun follicules ne se forment à la naissance (203). La formation du follicule implique également une activation de la voie de signalisation NOTCH (conservée chez tous les métazoaires). La perte de cette voie dans l’ovaire néonatal de souris entraîne une baisse importante du nombre de follicule primordiaux formés (204). L’activation de cette voie, témoignage d’un dialogue entre les cellules germinales et somatiques, resulte de la fixation d’un de ses ligands Jagged1 (JAG1), sécrété par les ovocytes, sur le récepteur Notch homolog 2 (NOTCH2), exprimé par les cellules de la granulosa. D’autres facteurs participent à l’assemblage folliculaire, comme la Connective tissue growth factor (CTGF) et l’Activine A (facteur de croissance de la famille du TGF-β). Alors que certains, tels que l’AMH, FGF2 et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) sont au contraire décrits comme inhibant cet assemblage (205).

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Chez l’être humain, l’entrée en méiose de l’ovocyte et l’assemblage folliculaire se fait de manière asynchrone pendant toute la vie fœtale et on observe des follicules secondaires et pré-antraux à partir du 3ème trimestre de grossesse. A la naissance, la fillette nait avec un pool de follicules primordiaux fixé (environ 1-2 millions). L’expression de certains facteurs décrits chez la souris dans l’assemblage folliculaire est retrouvée chez la femme, comme FIGLA (206), cependant les mécanismes chez l’humain se distinguent, permettant probablement que divers stades de différenciation des CG coexistent dans l’ovaire fœtal.

L’assemblage des cellules folliculaires, cellules de la pré-granulosas, autour des ovocytes permet la formation des follicules primordiaux. Les mécanismes entrant jeu dans la mise en place des cellules de la granulosa doivent être étudiés car cela affecte la folliculogénèse, entrainant une réduction du pool de follicules primordiaux disponibles et donc une insuffisance ovarienne prématurée (IOP).

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2. Folliculogenèse

La folliculogenèse regroupe les étapes de formation, croissance et maturation des follicules jusqu’à l’ovulation. La différenciation des follicules est un évènement tardif qui intervient au dernier tiers de la période de gestation chez la plupart des mammifères (ou après la naissance chez le lapin et les rongeurs). Les follicules sont constitués d’un ovocyte entouré d’une ou plusieurs couches de cellules somatiques folliculaires (suivant le stade de développement) : les cellules de la granulosa et les cellules de la thèque. La folliculogénèse démarre par la fragmentation des nids ovigères et la formation des follicules primordiaux. Cette formation se fait grâce à un dialogue entre les cellules somatiques et les cellules germinales (détaillée ci-dessus), les cellules de la pré-granulosa s’intercallant entre les ovocytes pour former une couronne cellulaire autour d’eux. Les ovocytes restés seuls dégénèrent par apoptose.

Les follicules primordiaux formés pendant la vie fœtale représentent un ensemble défini d’ovocytes disponibles pour la vie reproductive. Le nombre de follicules primordiaux est d’environ 1-2 millions à la naissance mais une forte atrésie folliculaire a lieu pendant l’enfance ne laissant que 400 000 follicules primordiaux disponibles au moment de la puberté. Sur ce pool, seulement quelques follicules primordiaux entreront en croissance et 400 à 500 ovocytes seulement seront ovulés et potentiellement fécondables. Ainsi, le stock de follicules décroit à chaque cycle jusqu’à ce que l’ovaire cesse de fonctionner, on parle alors de ménopause.

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78 Figure 14 : Représentation schématique de la folliculogenèse (adaptée de George et al., 2014). La FSH contrôle la croissance folliculaire aux stades pré-antral et antral puis la LH prend le relais lors de l’ovulation et de la lutéinisation. Les types cellulaires et structures de l’ovocyte sont indiqués directement sur le schéma.

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a) La croissance des follicules

La croissance des follicules se déroule en deux phases distinctes (Figure 14). La première étape consiste en une croissance basale indépendante de tout signal hormonal (principalement les gonadotropines hypophysaires, LH et FSH). Les follicules primordiaux sont alors activés, ils sortent du pool de follicules primordiaux et entrent en croissance, atteignant le stade de follicules à antrum chez la femme (ou pré-antral chez la souris). Cette étape se déroule dans la vie fœtale ou juste après la naissance pour les rongeurs. La seconde étape a lieu à la puberté et est activée à chaque cycle. Ainsi les follicules antraux sensibles aux gonadotrophines peuvent finir leur croissance mais un seul atteindra le stade de follicule ovulatoire. Les cellules de la granulosa se multiplient et produisent œstrogènes et inhibine sous l’effet de la FSH. En parrallèle, les cellules de la thèque sensibles à la LH produisent des androgènes nécessaires à la production d’œstrogènes. Oestrogènes et inhibine bloquent la production de FSH par rétro-contrôle négatif au niveau de l’axe hypothalamo-hypophysaire. La baisse de FSH permet une sélection des follicules sensible à la FSH même à basse concentration et seuls les follicules sensibles continuent leur croissance. Le follicule selectionné va alors finir sa croissance jusqu’au stade pré-ovulatoire. A ce stade les cellules de la granulosa sensibles à la FSH augmentent leur production d’œstrogènes et d’Inhibine et un rétro-contrôle positif entraine un pic de sécrétion de LH conduisant à l’ovulation (207).

b) Les cellules somatiques des follicules : origines et différenciation

i. Origine des cellules de la granulosa

Les cellules de la granulosa et les cellules de Sertoli ont un précurseur cellulaire commun, les cellules de l’épithélium cœlomique (208). L’étude des cellules somatiques des gonades d’embryons chimériques XX/XY a montré que certaines cellules de Sertoli pouvaient avoir un génotype XX et qu’à l’inverse des cellules de la granulosa pouvaient être XY, témoignant de cette origine commune (209, 210).

En 2012, l’équipe de Blanche Capel a montré que chez la souris, les cellules de la pré-granulosa sont générées, en deux vagues, à partir de l’épithélium cœlomique (211). Dans un premier temps, des cellules de la pré-granulosa se différencient entre 11,5 et 14,5 jpc à partir des précurseurs bipotentiels. Ces cellules de la granulosa constitueront les follicules présents à proximité de la medulla qui seront les premiers à croître. La seconde population de cellules de la pré-granulosa se

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différencie plus tardivement. Ces cellules formeront alors les follicules localisés vers le cortex qui seront activés seulement à la puberté (211).

ii. Les cellules de la granulosa et la croissance folliculaire

On l’a vu la formation des follicules primordiaux est le résultat d’un dialogue entre les cellules somatiques et les cellules germinales.

Par la suite, lorsqu'un follicule est activé, les cellules de la granulosa (trois à cinq cellules parentales) entourant l'ovocyte subissent au moins 10 divisions clonales pour arriver à plus de 2000 cellules dans le follicule antral mature (212). A partir de là, les cellules de la granulosa ne reçoivent aucun apport sanguin direct mais elles reposent sur une lame basale qui les sépare des cellules de la thèque interne vascularisées.

L'hormone stéroïde clé produite par les cellules de la granulosa est l'œstradiol. La synthèse de cette hormone nécessite là encore une collaboration avec les cellules de la thèque (voir ci-après) qui entourent le follicule et qui produisent des androgènes (déhydroépiandrostérone (DHEA), androstènediol, androstènedione, testostérone) en réponse à la LH. Ces androgènes diffusent ensuite dans les cellules de la granulosa et sont converties en œstrogènes (œstrone et estradiol), par l'aromatase du cytochrome P450 (ou CYP19A1) dans les cellules de la granulosa, en réponse à la présence de FSH (voir ci-après).

iii. Les cellules de la granulosa et l’ovulation

La FSH induit l’expression des récepteurs de la LH dans les cellules de la granulosa du follicule préovulatoire. Le récepteur de la LH (LHCGR) est d’ailleurs exprimé majoritairement dans les cellules de la granulosa des ces follicules. En revanche, l’expression du récepteur à la FSH (FSHR) diminuent dans les cellules de la granulosa à mesure que le follicule grandit. Cela entraine que dans les derniers stades de la maturation folliculaire, la LH prend le relais de la FSH en association avec une accélération de la maturation folliculaire (213).

Le follicule "choisi" pour ovuler synthétise lui de l'œstradiol en quantités importantes, entrainant sa détection dans la circulation systémique. Cette sécrétion ovarienne d'œstrogènes liée à l'émergence d’un follicule dominant est détectable aux alentours du 5ème jour du cycle (214). Lors de la poussée ovulatoire de LH, les cellules de la granulosa se différencient en cellules lutéiniques de la granulosa, population de cellules lutéales majeures du corps jaune. Elles sécrètent alors de la

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progestérone. Ce phénomène est en fait le résultat d’une régulation à la hausse de la voie de biosynthèse des lipoprotéines, dans les cellules de la granulosa, permettant la capture du cholestérol des lipoprotéines circulantes et sa convertion en progestatifs. D’ailleurs on observe une augmentation de l’expression des récepteurs LDL, et des gènes (principalement STARD1, CYP11A1 et HSD3B2) impliqués dans ce processus. Les cellules lutéiniques de la granulosa conservent aussi leur capacité de synthèse des œstrogènes à partir des précurseurs androgènes produits par les cellules de la thèque mais la baisse de sécrétion de LH est associée à une réduction considérable de la production de progestatifs et d'œstrogènes dans le corps jaune.

iv. Les cellules de la thèque

Les cellules de la thèque forment la couche externe des follicules à partir du stade de follicule secondaire. Elles produisent les androgènes qui sont convertis en œstrogènes par les cellules de la granulosa (cf. ci-dessus). Les cellules de la thèque sont spécifiées aux alentours de la naissance à partir de cellules localisées dans le stroma ovarien. Ces précurseurs ont pour origine des cellules mésenchymateuses du mésonéphros positives pour GLI1 (Glioma-associated oncogene homolog 1) et des progéniteurs gonadiques exprimant WT1 (215). Leur différenciation dépend de facteurs paracrines provenant de l’ovocyte (GDF9 pour Growth Differenciation Factor 9) et des cellules de la granulosa (IHH pour Indian HedgeHog/DHH pour Desert HedgeHog). D’ailleurs, les doubles KDs Ihh et Dhh entrainent un arrêt de la folliculogénèse au stade follicule pré-antral et sont associés à une absence complète de cellules de la thèque (215). Le KD de Gdf9 chez la souris conduit également à un arrêt de la folliculogenèse au stade de follicule primaire. Il y a une croissance correcte des ovocytes avec formation de la zone pellucide mais comme pour Dhh et Ihh les cellules de la thèque sont absentes (216). De façon assez intéressante en absence de Gdf9 l’expression d’Ihh ou Dhh est diminuée, ce qui pourrait expliquer l’observation de ces phénotypes assez similaires. Il est alors proposé que l’ovocyte produise GDF9, entrainant ainsi l’expression de Dhh et Ihh dans les cellules de la granulosa. La communication paracrine de ces facteurs serait alors associée à une différenciation des cellules stromales en cellules de la thèque. Ce type de régulation confirmerait que les cellules de la thèque et de la granulosa sont au centre d’un dialogue nécessaire à une folliculogénèse correcte.

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82 Figure 15 : Expressions normalisées de tous les facteurs FOX dans l’ovaire et le testis.

Figure réalisée via https://www.gtexportal.org/home/, niveaux d’expressions mesurés par RNA-seq et normalisée par la taille du transcrit chez l’humain. Plus la couleur tend vers le bleu plus l’ARN est présent, plus la couleur tend vers le jaune moins l’ARN est détecté.

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