La catalase (CAT) est également responsable de l'élimination d'H2O2 par une
transformation en H2O et O2. L’affinité de la catalase pour l'H2O2 est élevée seulement
lorsque les teneurs en peroxyde d'hydrogène sont accrues contrairement au Glutathion
Peroxydase (GSH-Px) (Mates et al., 1999;Powers et Lennon, 1999).
I.3.4.1.3. Le Glutathion Peroxydase
Le glutathion est un thiol très abondant se retrouvant de façon ubiquitaire chez les animaux et les végétaux.
Il possède deux formes redox distinctes. La forme réduite (GSH) est un tripeptide (γ
-Glu-Cys-Gly), stable, à fort pouvoir réducteur et très soluble dans l’eau et la forme oxydée (GSSG) issue de l’oxydation du glutathion avec formation d’un pont disulfure entre les cystéines de deux GSH. Dans les conditions physiologiques, les cellules maintiennent un ratio
GSH/GSSG très important, supérieur à 100 dans le cytosol et la mitochondrie (May et al.,
1998).
Le GSH joue plusieurs rôles. Il peut directement réduire l’H2O2 mais également
d’autres ERO notamment les hydroperoxydes organiques et les peroxydes lipidiques. Le GSH constitue une excellente protection contre la peroxydation lipidique de la membrane plasmique des spermatozoïdes. De ce fait, il arrête la réaction en chaîne progressive de la peroxydation des lipides.
38
I.3.4.2. Les antioxydants non enzymatiques I.3.4.2.1. L’acide ascorbique
La vitamine C est une vitamine hydrosoluble synthétisée à partir du D-glucose et agit
comme un réducteur (Chen et Gallie, 2004). L’on la retrouve particulièrement dans les fruits
et les légumes mais également dans les abats. Elle est essentielle dans de nombreuses fonctions du corps et a un rôle précis dans l’infertilité masculine.
L'acide ascorbique est un antioxydant important dans le testicule (Zhao et al., 2014).
Sa capacité antioxydante est estimée à environ 65% dans le plasma séminal (Agarwal et
Prabakaran, 2005).
Sa concentration est d’ailleurs 10 fois plus élevée dans ce liquide biologique que dans
le sang (Lewis et al., 1997). Il neutralise les ERO et empêche l'agglutination du sperme. C'est
un donneur d'électrons dans les systèmes redox, empêche la peroxydation lipidique, recycle la vitamine E et protège les spermatozoïdes contre des dommages d'ADN induits par le
peroxyde d'hydrogène (Angulo et al., 2011).
Des études associent une faible concentration en vitamine C dans le sperme à une diminution des activités enzymatiques des enzymes antioxydantes : superoxyde dismutase, catalase, glutathion réductase et glutathion peroxydase, augmentant les niveaux de peroxyde
d’hydrogène et la peroxydation des lipides dans les spermatozoïdes (Potts et al., 1999).
I.3.4.2.2. Vitamine E
Le terme vitamine E, désigne un groupe composé de huit molécules lipophiles (les α-, ß-, γ-, δ- tocophérol et les α-, β-,γ-, δ- tocotrienols) où l’α-tocophérol possède la plus grande
activité biologique (Weiser et Vecchi, 1982).
La vitamine E, tout comme la vitamine C, est un antioxydant très efficace du fait de sa
faible propension à être un donneur d’électrons (Bertrant, 2008).
Sa localisation, au niveau des membranes, en fait l’antioxydant le plus important dans
la prévention de la peroxydation des lipides membranaires (Fryer, 1992). Elle agit
principalement par transfert direct d’atomes d’hydrogène (Njus et Kelley, 1991).
L’α-tocophérol est un piégeur d’oxygène singulet et du radical hydroxyle (Krieger-Liszkay
39
Par ailleurs, il peut réduire les peroxydes lipidiques et bloquer la réaction en chaîne de
peroxydation lipidique s’initiant après la peroxydation d’acides gras polyinsaturés (Collin et
al., 2008). La vitamine E est donc un antioxydant clé dans la protection de l’intégrité des
membranes. Cet antioxydant est d’ailleurs considéré comme étant le plus important chez les
animaux et les humains (Bramley et al., 2000).
I.3.4.2.3. Le zinc
Le zinc est un métal de transition présent dans les molécules organiques. Sa similitude avec le cuivre quant à ses propriétés physico-chimiques fait qu’il y a une interaction
antagoniste entre zinc et cuivre (Imoberdorf et al., 2010).
En tant que partie intégrante et cofacteur de plus de 300 enzymes et 2000 facteurs de
transcription impliqués dans l’expression génique de différentes protéines, le zinc est
impliqué dans pratiquement tous lesdomaines métaboliques.
En plus des fonctions neurologiques, cicatrisantes et immunitaires, le zinc remplit des
tâches structurelles, régulatrices et catalytiques dans de très nombreux enzymes et est
important pour la configuration de plusieurs protéines non enzymatiques (Imoberdorf et al.,
2010).
Au niveau de la reproduction, le zinc a un rôle important dans le développement des
testicules et des paramètres spermatiques (Chia et al., 2000). Il influence la réaction
acrosomique (Riffo et al., 1992) et la décondensation de la chromatine (Kvist, 1980 ; Faure
et al., 2011). D’ailleurs, sa concentration dans le plasma séminal est plus élevée que dans les
autres tissus (Sorensen et al., 1999).
Le zinc a un effet antioxydant (antioxidant-like) contre les anions superoxydes
(Gavella et Lipovac, 1998). Selon Oteiza et al. (1995), une insuffisance d’apport en zinc
altèrerait les défenses antioxydantes, compromettant le mécanisme de réparation de l’ADN, exposant les spermatozoïdes aux dommages oxydatifs. Aussi des propriétés anti-apoptotiques
40
I
.
4.
Les métaux lourdsLes métaux sont des éléments du tableau de classification périodique situés à gauche de la diagonale définie par le bore, le silicium, le germanium, l’antimoine et le polonium
(Sirven, 2006). Parmi ces éléments, sont désignés métaux lourds, ceux dont la masse
volumique est supérieure à 5g /cm3 (Adriano, 2001).
D’un point de vue biologique, les métaux lourds n’ont aucun effet indispensable pour
le bon fonctionnement de l’organisme (Baize, 1997). Nous pouvons citer à tire d’exemples le
cadmium, le mercure et le plomb.
Dans ce qui suit, nous nous intéresserons particulièrement au plomb qui a été l’objet de notre étude.
I.4.1. Propriétés physico-chimiques du plomb
Plomb, du latin plombum, est un métal mou, gris, sans goût ni odeur caractéristique, se
trouvant habituellement en petite quantité dans la croûte terrestre.
Les principales données concernant les propriétés physico-chimiques du plomb et de
ses dérivés consignées dans le tableau I proviennent de l’ouvrage de Pascal (1963).
Le Pb appartient au groupe IV b de la classification périodique des éléments chimiques. Il possède deux électrons non appariés sur sa couche électronique externe. Cette configuration électronique autorise les degrés d’oxydation (+2) et (+4), en plus de la forme métal (0). Il existe 20 isotopes du plomb, dont 16 sont radioactifs et 4 naturels: 204Pb, 206Pb,
207Pb et 208Pb.Le cation Pb2+ est un acide au sens de Lewis, c'est-à-dire qu’il est susceptible
d’accepter un doublet d’électrons venant d’une base, pour former une liaison covalente. C’est également une espèce chargée, susceptible d’interactions électrostatiques avec
des ions de signes contraires pour former une liaison ionique (Sposito et al., 1982).
Le plomb possède une aptitude remarquable à se lier au carbone pour donner des
dérivés organiques. A titre d’exemple, le plomb tétraéthyle Pb(C2H5)4, était utilisé récemment
comme antidétonant dans l'essence. Ce composé est très volatile car il a un point d'ébullition de 200°C. Il est très soluble dans les huiles et les graisses. Sa combustion, par exemple dans un moteur à essence, conduit à la formation d'oxyde de plomb PbO.
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Tableau I: Principales propriétés physico-chimiques du plomb (Pascal, 1963)
Symbole Pb
Numéro atomique 82
Masse atomique 207,2 g. mol-1
Point de fusion 3270°C Point d’ébullition 1740°C Densité 11,35 Valence 0 ; 2 ; 4 Rayons ioniques Pb+2 Pb+4 0.94 à 1,49 Å 0,78 à 0,94 Å
42
I.4.2. Le plomb dans l’environnement I.4.2.1. Historique de l’utilisation
Les anciens écrits attestent de la présence du plomb (Pb) et de son utilisation du temps des Egyptiens, Grecs, Romains et Hébreux. L’on rapportait déjà son utilisation en céramiques
et la maitrise de son extraction entre 4000 à 2000 ans avant notre ère (Berglund et al., 2008).
Sa malléabilité, sa facilité d’extraction, son bas point de fusion ainsi que sa grande disponibilité en ont fait un métal de prédilection pour la fabrication et la production d’un nombre important de produits, allant des pigments de peintures pour céramique à la tuyauterie, jusqu’à son utilisation dans certains produits cosmétiques.
Plus récemment, le plomb a aussi été largement utilisé comme antidétonant pour les carburants automobiles. Il participe aussi à la fabrication de batteries d’accumulateurs. Ces propriétés ont également permis son utilisation comme anticorrosif dans la protection de câbles, de fils d’acier ou de lignes téléphoniques.
En alliage avec d’autres métaux, il permet de produire des fils et des bâtons de soudure, des caractères d’imprimerie (Pb/Sb), des bronzes à ciseler, des projectiles de munitions. La capacité qu’a le plomb d’absorber les rayonnements X et gamma (γ) trouve une application dans la production de matériels de radioprotection. Divers oxydes et sels de plomb ont été employés pour la production de peintures, d’encres, d’émaux, de matières plastiques, de colorants capillaires. Le plomb est également utilisé en verrerie, notamment
pour la production de cristal (Garnier, 2005).
I.4.2.2. Pharmacocinétique du plomb
Il importe d'évaluer les différentes phases de la pharmacocinétique du plomb de
l'absorption à l'élimination en passant par les mécanismes de transfert dans les différents
tissus et le stockagedans certains organes, pour en tirer des réponses quant à l'évaluation des
risques etla surveillance biologique des personnes exposées.
I.4.2.2.1. Absorption.
Voie pulmonaire.
L’absorption par voie pulmonaire dépend de la taille des particules (Taylor, 1986 ;
Garnier et Poupon, 2004). Le pourcentage de plomb ainsi absorbé dépend de leur solubilité,
43
Globalement, on estime qu’environ un tiers du plomb est absorbé par inhalation, l’absorption pouvant atteindre 70 % sous l’effet de la température.
L’absorption par voie pulmonaire joue un rôle important pour les personnes exposées en milieu industriel ou qui vivent sous les rejets atmosphériques, dans l'environnement des entreprises polluantes. Les mécanismes et facteurs d'efficacité de l'absorption mis en jeu lors
de l'inhalation d'un air contaminé par le plomb ont été envisagés par Friberg et al. (1986).
Le plomb atmosphérique peut exister sous forme de vapeurs, de gaz ou de particules. Les vapeurs et gaz des composés métalliques étant peu solubles dans l'eau, migrent jusqu'aux alvéoles pulmonaires où ils passent dans le sang. Quant aux particules métalliques, elles se déposent dans le tractus respiratoire selon plusieurs procédés: impact au niveau du nez, de la trachée et des grandes bronches pour les particules les plus grosses soumises à un flux d'air important, sédimentation au niveau des voies aériennes de plus faible diamètre et des alvéoles pour les poussières d'assez grande taille véhiculées par un flux d'air faible; diffusion pour les particules les plus fines.
Voie digestive
Les sources de plomb peuvent également être constituées par les aliments contaminés
telles que le lait, les boissons et l'eau du robinet, de même que les écailles de peinture, les
poussières domestiques ou les sols.
La biodisponibilité du plomb dépend de sa solubilité dans le tractus gastro-intestinal. Le pH des muqueuses digestives est très variable: de très acide au niveau de l'estomac, il devient faiblement acide dans le jéjunum et neutre ou légèrement alcalin dans le duodénum. Le plomb doit être solubilisé pour être absorbé.
Voie cutanée
Seuls les composés organiques du plomb, liposolubles, utilisent cette voie, sauf si la
peau est lésée (Botta et al., 1976). Néanmoins, selon Lilley et al. (1988) cette voie pourrait
44
Distribution
Après absorption, le plomb passe dans le sang où il se répartit dans les hématies, sous une forme non diffusible, et dans le plasma en partie sous forme diffusible, avant de se fixer dans les tissus ou d’être éliminé. Le sang est donc le “ carrefour ” de tous les trajets du plomb dans l'organisme.
Lolin et O'Gorman (1988) considèrent que le plomb est d'abord lié aux fractions
membranaires avant d'être redistribué dans l'hématie.
A l'équilibre, 52 % du Pb intracellulaire est fixé à l'hémoglobine, 24 % aux sites de liaisons plus faibles, le reste étant sous forme libre. Le système d'accumulation du plomb dans l'hématie est saturable. Dans les hématies, le plomb membranaire, qui représente environ 14 % du plomb sanguin, est lié à 88 % au niveau des protéines et moins de 10 % au niveau des phospholipides. Les groupements carboxyliques sont responsables d'environ 68 % de ces liaisons et les groupements thiols de 18 %.
Des études in vitro ont exploré les mécanismes du transport du plomb dans les
hématies: elles ont montré que la pénétration est très rapide, dans les 5 premières minutes de
contact, puis qu'il y a un ralentissement. D’ailleurs, selon Lolin et O'Gorman (1986), 97 %
du plomb est fixé après 15 minutes d’absorption. La vitesse serait liée à la quantité
d'hémoglobine susceptible de fixer le plomb (Barton, 1989).
Le transport s'effectue à 90 % par un mécanisme passif, aussi bien pour 1'entrée que pour la sortie des hématies. La vitesse d'entrée est directement proportionnelle à la quantité de
plomb et d'ions HCO3- et 1'addition de HCO3- diminue la quantité de plomb libre.
Ces résultats suggèrent que le transport de ce métal dépend de la formation de PbCO3
et passe par un système échangeur d'anions (Simons, 1986a, b et c).
Elimination
Selon Sugita (1978), le plomb serait éliminé de l'organisme selon trois phases: une
première ; rapide, correspondrait à l'élimination du plomb non fixé; une seconde ; lente, représenterait la fraction du plomb faiblement liée; une troisième ; très lente, pourrait intervenir que plusieurs années après les deux premières, car elle correspond au plomb fortement fixé notamment au niveau osseux.
L'excrétion du plomb peut s'effectuer par plusieurs voies. Chez l’homme, la voie
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La concentration urinaire est proportionnelle au plomb plasmatique, de sorte que la quantité de plomb filtrée reste faible puisque l’énorme majorité du plomb sanguin est fixée
aux hématies (Bismuth et al., 2000).
La quantité de plomb contenue dans les fèces reflète plus le plomb non absorbé par
l’intestin que le plomb excrété par voie biliaire (Rabinowitz et al., 1978). Le plomb peut être
aussi éliminé par la salive, la sueur, les cheveux et les ongles.
I.4.3. Principaux effets toxiques sur la santé humaine
Les signes cliniques d’exposition chronique au plomb sont peu spécifiques car les
symptômes demeurent pour la plupart du temps discrets et insidieux (Saka et al., 2011). Les
principales pathologies sont très variées et dissemblables.
On relève à titre d’exemple les syndromes abdominaux, l’encéphalopathie, les neuropathies périphériques, les atteintes neurologiques, les atteintes rénales, l’hypertension
artérielle, le cancer, les effets hématologiques et les troubles reproductifs (Garnier, 2005).
De ce qui precède, seuls les effets sur le système reproducteur mâle retiendront notre attention.
I.4.3.1. Effets du plomb sur la biosynthèse des hormones sexuelles
Plusieurs études réalisées chez l'animal ont montré que le mâle exposé pendant
plusieurs semaines, présentait un hypogonadisme (Lamia et al., 2008). Le plomb agit
directement sur les cellules de Leydig en réduisant la biosynthèse de testostérone et des gonadotrophines. Pour des plombémies supérieures à 600 mg/L, une diminution de la concentration de testostérone circulante peut être observée, en association avec une perturbation du fonctionnement de l'axe hypothalamo-hypophysaire touchant la sécrétion de la LH. Pour des plombémies inférieures à 400 mg /L, la production des spermatozoïdes ou des hormones sexuelles ne semble pas affectée. De plus, les conséquences d’une exposition paternelle semblent être associées à une augmentation du risque d’avortement spontané, mais pas avec celui de malformations congénitales.
I.4.3.2. Effets du plomb sur les spermatozoïdes et leur pouvoir fécondant
La production de spermatozoïdes est de même altérée, mais une tératospermie est parfois observée. Pour des plombémies de l'ordre de 400 mg/L, le pouvoir fécondant des
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Chez le singe exposé toute sa vie à de faibles doses de plomb (plombémies de l00 mg/L), une altération de la chromatine des spermatozoïdes a été observée. De plus, la fertilité des animaux mâles exposés est fortement affectée; des morts fœtales peuvent se produire pour de fortes intoxications chez le mâle.
L'expérimentation animale démontre clairement que le plomb administré à forte dose pendant la gestation est tératogène et peut entraîner des morts fœtales alors qu'à dose modérée avant et/ou pendant la gestation, il réduit la taille des portées, le poids des nouveaux nés et leur survie.
Chez l'homme, en milieu professionnel, une exposition chronique au plomb révélée par des plombémies supérieures à 400 mg/L peut entraîner une diminution de la production des spermatozoïdes qui accroît le risque d'hypofertilité.
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II. Materiel et Methodes
II. MATERIEL
ET
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II-1- Type et cadre d’étude
Il s’agit d’une étude expérimentale basée sur l’utilisation des techniques d’histologie classique (réalisation des coupes), de spectrométrie (dosages des métaux, des hormones et du malondialdéhyde), de biologie moléculaire pour l’évaluation de l’expression gènes codant pour les enzymes antioxydants et des protéines anti et pro-apoptotiques.
Ce travail a été réalisé essentiellemnet dans les laboratoires de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire (IPCI) et dans les laboratoires d’autres institutions de recherche.
- Les dosages hormonaux ont été réalisés au départément de Biochimie Fondamentale et Médicale de l’IPCI.
- Le dosage du malondialdéhyde (MDA) a été réalisé au Laboratoire National de Santé Publique (LNSP).
- Le dosage du plomb et du zinc a été réalisé au Laboratoire des Procédures Industrielles de Synthèse de l’Environnement et des Energies Nouvelles (LAPISEN) de l’Institut Polytechnique Félix Houphouët-Boigny (INPHB) de Yamoussoukro.
- Le Laboratoire d’Anatomie-pathologie du Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Treichville a contribué à la réalisation des coupes histologiques.
- L’extraction de l’acide ribonucléique (ARN) et les tests immunochimiques ont été réalisés à l’Unité de Biologie Cellulaire (UBIC) de l’IPCI.
- Les analyses moléculaires ont été réalisées à la plateforme de Biologie Moléculaire de l’IPCI.
II.2. Matériel
II.2.1. Matériel biologique
Dans ce protocole expérimental, le modèle animal choisi a été le rat Wistar (Rattus
norvegicus). Les expériences ont été réalisées sur de jeunes rats mâles pubères, âgés de 90 ± 5
jours et de poids moyen 250 ± 20 g. Les animaux ont été fournis par l’Ecole Normale Supérieure (ENS) d’Abidjan. Ils ont séjourné dans l’animalerie de l’IPCI à température ambiante (25 ± 2°C), sous aération suffisante, dans des cages conventionnelles collectives en plastique tapissées de copeaux de bois, munies d’une mangeoire et d’un biberon.
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Au cours de l’expérimentation, les périodes de lumière et d’obscurité étaient contrôlées (environ 10 heures de lumière et 14 heures d’obscurité) dans l’animalerie par le système électrique.
Les animaux, ont été nourris avec des granulés fabriqués et commercialisés par Ivograin Côte d’Ivoire. Ces granulés étaient constitués de 15 % de matière protéique, 3,5% de matière grasse, 12 % de matière cellulosique, 9% de matière minérale. Ils ont eu libre accès à l’eau. Les rats ont été acclimatés à cet environnement durant 14 jours avant l’expérimentation.
II.2.2. Matériel technique
En dehors du petit matériel de laboratoire, le matériel technique utilisé dans cette étude
était constitué essentiellement d’une étuve (Selecta, Suisse) pour maintenir les solutions
préparées et les échantillons aux températures nécessaires à l’expérimentation, d’un
microscope optique (Olympus, Japon) pour l’appréciation des paramètres spermatiques et le
dénombrement des cellules apoptotiques. En outre, une centrifugeuse (Electron Corporation
Thermo MR 1822, France) a été utilisée pour la séparation des phases dans les échantillons.
Pour le dosage du plomb et du zinc, un Spectrophotomètre d’Absorption Atomique
(Varian AA20, Danemark) a été utilisé. Un spectrophotomètre (Analytik Jena Specord 210
plus, Allemagne) a servi au dosage du MDA.
Pour le dosage des hormones sexuelles et du cholestérol ainsi que de ses dérivés, un
automate de marque Architech (3000 i plus, France) a été utilisé.
En ce qui concerne les analyses moléculaires, un appareil de marque Quibit
(Introvergen 3.0 Fluorometer, Malaisie) a été utilisé pour la quantification de l’ARN
contenu dans les broyats testiculaires.
La qualité de l’ARN extrait, a été appréciée après migration en électrophorèse (E-C
Apparatus Corporation, USA) sur gel d’agarose (Introgen®). Pour la visualisation des
bandes 28S et 18S contenues dans les acides ribonucléiques de chaque échantillon, un
automate de type ; Gel Documentation, Bio-Rad Laboratories, USA, a été utilisé. Enfin, un
thermocycleur (Applied Biosystems 7500 Fast, USA) a permis d’évaluer l’expression des
enzymes et des gènes par RT-PCR.
Tout au long de ces travaux, un congélateur (Electroluxe) a servi à conserver les
amorces des séquences des enzymes anti-oxydants et des cytokines utilisés. En outre, un
réfrigérateur (Electroluxe) a été utilisé pour la conservation du marqueur de poids
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II.2.3. Réactifs et solutions
L’isofluran (1-Chloro-2,2,2-trifluoroethyl-difluoromethylether, Forene, Abbott,
Allemagne) a servi à anesthésier les animaux avant de les euthanasier.
Le dihydrogenophosphate de Sodium (NaH2PO4, Ferak, Allemagne),
l’hydrogenophosphate de Sodium (Na2HPO4, Ferak, Allemagne), l’éosine (Merck,
Allemagne) et la gélatine (Baltimore Maryland, USA) ont servi à préparer le tampon
phosphate de sodium (tampon S).
Des cassettes de type ; Architect X 100, Abott, France, ont été utilisés pour le dosage
des hormones sexuelles et du cholestérol ainsi que de ses dérivés.
La coloration de Papanicolaou (Bio Optica, Italie) a été utilisée pour colorer les