I
A
Par
Année Universitaire 2018-2019
Laboratoire de
Pharmacodynamie-Biochimique
THESE
Présentée pour l’obtention du titre de Docteur de l’Université Félix Houphouët-Boigny
REPUBLIQUE DE COTE D’IVOIRE Union-Discipline-Travail Ministère de l’Enseignement supérieur
et de la Recherche Scientifique
M. KONAN Kouassi Martin Spécialité : Biologie Fonctionnelle et Moléculaire
PLOMB ET INFERTILITE MASCULINE:
PARAMETRES SPERMATIQUES, MISE EN EVIDENCE DU PHENOMENE D’APOPTOSE ET
EVALUATION DE L’EXPRESSION DES GENES PAR RT-PCR CHEZ LE RAT WISTAR
Numéro d’ordre 2229/2019
Soutenue publiquement Le 08 Novembre 2019
Commission du jury
M. N’GUESSAN Jean David Professeur Titulaire UFHB Président M. DJAMAN Allico Joseph Professeur Titulaire UFHB Directeur M. KOUAKOU Koffi Professeur Titulaire UFHB Rapporteur Mme KOUASSI Affoué Sangaré Maître de Recherche INHP Rapporteur M. COULIBALY Founzégué A. Maître de Conférences UFHB Examinateur
Option : Biologie Moléculaire et Biologie de la Reproduction
I
AVANT-PROPOS
Depuis plusieurs années, les préoccupations concernant les effets de la pollution sur la santé humaine et animale s’immiscent de plus en plus au cœur des débats politiques et scientifiques.
D’origine naturelle ou synthétique, les polluants peuvent altérer le fonctionnement du système hormonal des animaux et des hommes. Ces substances pourraient donc induire des effets néfastes sur les organes reproducteurs de la population, et constituer un danger sanitaire qui est encore aujourd’hui mal étudié. Notre société est de nos jours confrontée à une baisse de fertilité de la population, qui ne cesse de s'accentuer depuis ces dernières décennies. On estime aujourd'hui que 15 % des couples consultent au moins une fois dans leur vie pour un problème d'infertilité. L'environnement et le mode de vie sont pour beaucoup responsables de cette baisse de fécondité, notamment avec l'omniprésence de polluants de tout genre.
Ce travail de recherche conçu conjointement par les équipes de recherche du Laboartoire de Pharmacodynamie-Biochimique de l’Université Félix Houphouët-Boigny de Cocody et de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire avait pour but d’évaluer les effets cytotoxiques du plomb sur les fonctions sexuelles endocrine et exocrine chez les rats mâles Wistar. Il s’inscrit dans la continuité des travaux réalisés lors de notre Master qui ont permis de révéler la présence de plomb et de cadmium dans le sperme des patients consultant pour infertilité masculine à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire.
Ce présent travail qui a consisté à comparer les paramètres spermatiques, la spermatogenèse, le phénomène d’apoptose et l’expression des enzymes anti-oxydants (superoxyde dimustase, glutathion peroxyde et catalase) des rats issus d’une exposition chronique (lot expérimental) par voie orale au plomb à ceux des rats non exposés (lot contrôle).
Les résultats obtenus ont montré que les rats exposés au plomb présentaient des paramètres spermiologiques (vitalité, motilité, densité et anomalies) significativement réduits (p ˂ 0,05) et des perturbations dans le déroulement de la spermatogenèse. En outre, l’approche moléculaire de ce travail a révélé une surexpression du superoxyde dismutase (SOD) et une sous-expression du glutathion peroxydase et de la catalase. Egalement les tests immuno- histochimiques ont montré que les rats abreuvés au plomb présentaient un nombre de cellules apoptotiques significativement plus élevé que les rats du lot contrôle.
Ces résultats ont été valorisés par deux publications dans des journaux à comité de lecture et cinq communications dont trois affichées (posters) lors de congrès scientifiques internationaux (Allemagne, Ghana et USA) avec en prime la distinction de la meilleure communication affichée lors du congrès d’Atlanta (USA).
II
DEDICACES ET REMERCIEMENTS
DEDICACES
ET
REMERCIEMENTS
III
DEDICACES
AU DIEU TOUT PUISSANT
Je ne saurai comment te remercier Seigneur pour tous tes bienfaits à mon égard. Si j’ai pu reprendre les études et atteindre ce but, c’est par ta Grâce et ta Miséricorde. Puisse ta crainte m’habiter davantage.
A MON TRES CHER PERE
Tu as été et tu seras toujours un exemple pour moi par tes qualités humaines et ton goût prononcé pour la perfection. En ce jour, j’espère réaliser l’un de tes rêves à travers ce travail qui pour moi est le fruit de tous tes efforts et sacrifices. Puisse Dieu te combler de bonheur et de satisfaction
A MA TRES CHERE MERE
Source inépuisable de tendresse, de patience et de sacrifice, tes prières et tes bénédictions m’ont été d’une grande utilité tout au long de mon parcours scolaire et universitaire. Quoique je puisse écrire, je ne pourrai exprimer ma grande affection et ma profonde reconnaisse. Puisse Dieu te préserver et t’accorder santé et longévité.
A MON EPOUSE
Konan Evelyne, aucune dédicace ne pourrait exprimer mon amour et mon attachement à toi. Tout au long de ces années de recherche, tu n’as cessé de me soutenir et de m’épauler. Ta présence m’a procuré confiance et stabilité. Fasse Dieu que nous vivions d’autres moments aussi mirobolants que ceux nous savourons maintenant.
A MES ENFANTS
Konan Jériel Onésime Melchi, Konan Sheila Hira Bérénice et Konan Chloé Loïs Kyria, vos présences à mes cotés pendant la rédaction de ce manuscrit constituaient une motivation supplémentaire pour moi. Fasse Dieu que vous aussi dans vos cursus vous puissiez connaître pareil couronnement.
IV
REMERCIEMENTS
En préambule à ce manuscrit, je souhaite exprimer ma gratitude à toutes les personnes qui ont contribué, de près ou de loin, à l’aboutissement de la présente thèse. C’est en arrivant au bout du chemin que l’on peut apprécier la distance parcourue et se réjouir d’avoir été accompagné, guidé et soutenu tout au long de cette aventure.
M. KARAMOKO ABOU, PRESIDENT de l’Université Félix Houphouët-Boigny Professeur Titulaire de Philosophie ; Je voudrais vous remercier avec déférence pour la confiance placée en moi en acceptant mon inscription au sein de cette prestigieuse Université.
M. KOUAMELAN ESSETCHI PAUL, DOYEN de l’UFR Biosciences
Professeur Titulaire d’Hydrobiologie ; Je tiens à vous témoigner ma reconnaissance pour avoir accepté ma candidature au sein de votre Unité de Formation et de Recherche (UFR) pour faire cette formation doctorale.
Mme DOSSO MIREILLE, DIRECTRICE de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire Professeur Titulaire de Microbiologie à l’UFR des Sciences Médicales de l’Université Félix Houphouët-Boigny, qu’il me soit permis de vous exprimer un modeste témoignage de ma profonde estime. Je voudrais vous témoigner à travers ce travail ma gratitude pour m’avoir accueilli dans votre prestigieux institut pour réaliser ces travaux de recherche.
Les années que j’y ai passées m’ont permis d’acquérir la rigueur indispensable à tout travail de recherche. En outre, au sein de votre Institut, j’ai pu prendre part à plusieurs ateliers de formation et congrès scientifiques internationaux qui m’ont été d’un apport inestimable.
Recevez ici l’expression de ma sincère reconnaissance et de mon profond respect.
V
M. N’GUESSAN JEAN DAVID, Président du Jury
Professeur Titulaire de Biochimie et de Pharmacologie des Substances Naturelles, Vice-Doyen chargé de la Pédagogie à l’UFR Biosciences, Directeur-Adjoint du Laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique.
Qu’il me soit permis de vous remercier et de vous exprimer mon estime et mon profond respect. Cher Honorable Professeur, vous avez toujours éveillé en moi l’esprit de recherche par votre parcours académique exemplaire, votre dynamisme, votre courtoisie, votre humilité et votre abnégation pour le travail bien fait. Vous avez toujours été à l’écoute des étudiants malgré votre agenda chargé.
Je voudrais vous traduire ma sincère reconnaissance. Les mots ne suffisent pas pour vous exprimer toute ma gratitude et toute ma reconnaissance pour avoir accepté de présider ce Jury de Thèse. J’en suis persuadé que vos remarques et suggestions permettront d’améliorer la qualité de ce manuscrit.
Veuillez accepter ma profonde gratitude pour l’aide considérable que vous m’avez apporté. Vous êtes un Enseignant-Chercheur aux immenses qualités. Fasse Dieu que je puisse vous ressembler.
M. DJAMAN ALLICO JOSEPH, Directeur de la Thèse
Professeur Titulaire de Biochimie et de Parasitologie, Directeur du Laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique, Chef du Département de Biochimie Médicale et Fondamentale à l’Institut Pasteur Côte d’Ivoire, Doyen Honoraire de l’UFR Biosciences.
Cher Directeur, je voudrais traduire ma reconnaissance à votre endroit pour m’avoir accepté dans votre Laboratoire pour reprendre mes études. En le faisant vous avez permis la réalisation d’un rêve caressé depuis près d’une décennie après l’obtention de ma Maitrise.
Je voudrais par ailleurs vous remercier pour le stage que vous m’avez permis de faire à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, qui m’a été très bénéfique.
En outre, vous m’avez permis de réaliser combien la recherche était passionnante et méritait un véritable investissement. Vous avez été un Directeur hors pair, et la confiance que vous m’avez accordée a su créer l’environnement nécessaire à la réalisation de ce projet. A vos côtés j’ai pu acquérir l’autonomie et, je l’espère, l’esprit scientifique critique qui me seront nécessaires tout au long de ma carrière professionnelle. Je n’oublierai jamais votre enthousiasme et votre profonde humanité. Durant ces années de recherche, j’ai eu la chance de vous avoir en tant que Directeur de Thèse.
VI
Vous m’avez toujours remonté le moral lorsque j’étais pris de désespoir et c’est même vous qui m’avez tracé les sillons d’une issue favorable qui portent aujourd’hui ses fruits. Je ne cesserai de vous remercier et je ne saurai trouver les mots justes.
Votre attention particulière m’a permis de finaliser ce travail. Trouvez ici l’assurance de ma reconnaissance. Puisse Dieu exaucer vos vœux les plus chers.
M. KOUAKOU KOFFI, Rapporteur
Professeur Titulaire de Physiologie Animale, Directeur du Laboratoire d’Endocrinologie et de Biologie de la Reproduction. Cher Professeur, je voudrais vous traduire ma reconnaissance pour votre sympathie et votre sens aigu de la collaboration scientifique. Merci de m’avoir ouvert les portes de votre laboratoire. Cette collaboration nous a permis de mener à bien ce projet notamment le volet consacré à l’histologie.
Je souhaite que notre collaboration se pérennise afin de promouvoir une Biologie de la Reproduction novatrice.
Merci également de prendre part à ce Jury en qualité de Rapporteur Interne.
Mme KOUASSI AFFOUE Epse SANGARE, Rapporteur
Hémobiologiste, Maître de Recherche à l’Institut National d’Hygiène Publique (INHP), je voudrais vous traduire ma reconnaissance pour avoir accepté d’intruire ce travail en qualité de Rapporteur Externe. Vos observations nous ont permis de mieux cerner le sujet. Merci pour votre coutoisie et pour le temps que vous m’avez consacré.
M. COULIBALY FOUNZEGUE AMADOU, Examinateur
Maître de conférences au Laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique de l’UFR Biosciences, je vous remercie de votre soutien durant ces années de recherche. J’ai encore en mémoire ces mois passés à l’Unité de Biologie de Reproduction de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire. C’est d’ailleurs au sein de cette unité que j’ai fais mes premiers pas dans la recherche scientifique. Merci d’avoir donné votre accord pour faire partie de ce Jury en qualité d’Examinateur. Je reste convaincu que vos critiques et observations permettront de renforcer ce travail. Soyez assuré de ma profonde estime.
VII
M. YEO DODEHE
Maître de conférences au Laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique de l’UFR Biosciences, je vous remercie pour avoir accepté d’analyser ce travail. Vos remarques et suggestions nous ont permis d’améliorer la qualité de ce manuscrit.
M. ADON MOUSAN ARSENE
Chargé de Recherche à l’Institut Pasteur Côte d’Ivoire, Chef de l’Unité Biologie Cellulaire (UBIC), Cher Maître, j’ai été touché par la bienveillance et la sympathie avec lesquelles vous m’avez accueilli au sein de l’unité que vous dirigez. J’ai été émerveillé par vos qualités de chercheur. A vos côtés, j’ai perçu la quintessence de cette citation de Gaston Bachelard « Le savant c’est celui qui a une tête et une main.» Merci de m’avoir initié aux techniques de Biologie Moléculaire.
J’ai encore en mémoire ces fois où toute l’équipe de recherche restait au laboratoire pour des manipulations tard la nuit. Ce sont des moments qui ont forgé en nous abnégation, détermination et patience.
Votre habilité à diriger une équipe de recherche et votre expérience resteront pour moi un modèle. Il a été particulièrement agréable de me former à vos côtés. Merci de m’avoir supporté, écouté, et conseillé. Vous avez aussi suscité en moi cette passion pour les congrès scientifiques. Puisse Dieu vous appeler à des responsabilités plus grandes au cours de votre carrière.
M. M’BOH GERVAIS MELAINE
Maître de Recherche à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, Chef de Département Formation et Renforcement des Capacités, Chef de l’unité de Biochimie analytique. Cher encadreur vous êtes pour moi un modèle par votre fulgurante ascension, ne dit on pas qu’aux âmes bien nées la valeur n’attend point le nombre d’années? Merci d’avoir facilité ma rencontre avec Dr Adon Mousan Arsène.
Que ce travail soit le reflet de la confiance que vous m’avez toujours témoignée.
Veuillez trouvez ici l’assurance de ma reconnaissance. Fasse Dieu que votre récente promotion en appelle d’autres.
VIII
M. AOUSSI SERGES
Chargé de Recherche à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, Chef du Département Technique et Technologie (DTT), je vous remercie pour le soutien et les conseils que vous m’avez prodigués durant ces années de recherche.
M. ADJOGOUA EDGAR VALERY
Attaché de Recherche à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, Chef du Département Virus Endémiques (DVE). Je vous remercie pour la collaboration qui a existé entre votre unité et celle dans laquelle j’ai effectué mes travaux.
Votre contribution nous a été très bénéfique dans la réalisation des manipulations.
Recevez ici le témoignage de ma profonde reconnaissance.
M. KADJO ADJE HERVE
Attaché de Recherche à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, Chef de l’Unité des Virus Respiratoires. J’ai apprécié votre sens aigu de synthèse et votre rigueur scientifique. Recevez ici le témoignage de ma profonde reconnaissance.
M. COULIBALY N’GOLO DAVID
Chargé de Recherche à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, Responsable Adjoint de la plateforme de Biologie Moléculaire. Votre avis spécialisé et vos conseils avisés m’ont aidé dans l’élaboration de ce projet thèse. Soyez assuré de ma profonde estime
M. DJIH BERNARD
Maître-assistant au Laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique de l’UFR Biosciences, vous m’avez toujours écouté attentivement et aidé inlassablement. Merci pour vos conseils avisés. Soyez assuré de mon estime.
M. KOBY DAMA ALBERT
Médecin; Attaché de Recherche à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, Adjoint au Chef d’Unité de Biologie Cellulaire. Je voudrais vous témoigner ma gratitude pour vos conseils et vos encouragements.
IX
M. KOFFI KOUAKOU EUGENE
Médecin-Vétérinaire, Attaché de Recherche à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, Chef de l’Unité de Gestion des Ressources Animales de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire. Cher ancien condisciple, je vous remercie pour le soutien apporté à ce projet.
M. KOUASSI KONAN
Maître-assistant au Laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique de l’UFR Biosciences ; Cher Docteur, je voudrais vous témoigner ma reconnaissance pour tout le temps que vous m’avez consacré durant la réalisation de ces travaux.
M. ADJE FELIX
Maitre-assistant à l’Institut National Polytechnique Félix Houphouët-Boigny (INPHB) de Yamoussoukro. Cher Docteur, je voudrais vous traduire ma reconnaissance pour avoir facilité mon insertion au sein de ce prestigieux institut pour la réalisation de certains pans de ce projet thèse.
A MES FRERES ET SŒURS
Konan Affoué Lucie, Konan Olivier Arthur, Konan Yves Guillaume, Koffi Marie Claire, Konan Eric Stéphane, Konan Ahout Geneviève et Konan Adjoua Annick, je voudrais traduire à chacun de vous mes remerciements pour les encouragements dont j’ai été l’objet. Vous avez été d’un soutien inestimable tout au long de ces années passionnantes qu’ont été ce quinquennat de recherche. Fasse Dieu que cette grâce en appelle d’autres au sein de la famille.
A MES AMIS
N’Guessan Asué Julien, Assalé Jean Claude, Blothier Innocent, Bahino Julien, Koffi Alexis, Doh Koffi Stéphane, Ligbé Charles, Fougoh Olivier, Zougrou N’Guessan Ernerst, By Philémond, Miezan Bile, Touré Prospère, Sylla Mohamed. Il me serait difficile de vous citer tous, merci pour votre soutien et votre présence à mes côtés durant ces moments inoubliables. Puisse Dieu vous le rendre au centuple.
X
A l’ensemble des Enseignants-chercheurs et Chercheurs du Laboratoire de Pharmacodynamie- Biochimique, j’adresse mes remerciements pour la formation et le soutien dont j’ai pu bénéficier lors de ces années de recherche.
Professeurs Titulaires
Monsieur DJAMAN A. Joseph Directeur du laboratoire
Professeur titulaire
Monsieur BIDIE A. Dit Philippe Professeur titulaire
Monsieur COULIBALY Adama Chef d’unité
Professeur titulaire
Monsieur N’GUESSAN Jean David Vice-Doyen Professeur titulaire
Monsieur YAPI H. Félix Professeur titulaire
Monsieur YAPO A. Félix Professeur titulaire
Maîtres de Conférences
Monsieur BAGRE Issa Maître de conférences
Monsieur BAHI Calixte Maître de conférences
Monsieur BLA K. Brice Maître de conférences
Monsieur COULIBALY Founzégué Amadou Maître de conférences
Monsieur KRA Adou M. Maître de conférences
Monsieur OUATTARA Karamoko Maître de conférences
Madame THES P. Marie Epse SOUMAHORO Maître de conférences
Monsieur TREBISSOU Johnson Noël Maître de conférences
Monsieur YEO Dodéhé Maître de conférences
Maîtres-Assistants
Madame AGRE Josette Épse KOUADIO Maître-assistant
Monsieur AHUA Maximin Maître-assistant
Monsieur DJYH Bernard Nazaire Maître-assistant
Monsieur KOUASSI Konan Maître-assistant
Monsieur KOUASSI K. Serge Maître-assistant
Monsieur PAKORA Gilles Alex Maître-assistant
Monsieur OUATTARA Sitapha Maître-assistant
XI
Chargés de Recherche
Monsieur AKAPO-AKUE Joël Chargé de Recherche
Monsieur KIPRE G. Rolland Chargé de Recherche
Madame LUTTY A. Constance Chargé de Recherche
Assistants
Monsieur BAMBA Abou Assistant
Monsieur DAGNOGO Oléfongo Assistant
Monsieur YOUAN G. Pascale Assistant
Enseignant du secondaire détaché
Madame KONE Salimata Épse COULIBALY Professeur certifié
J’exprime également ma profonde gratitude à ceux qui m’ont apporté leur soutien d’une manière ou d’une autre et dont les noms ne figurent pas dans ce présent document.
Que DIEU vous le rende aux multiples
XII
TABLE DES MATIERES AVANT-PROPOS
DEDICACES ET REMERCIEMENTS ... II DEDICACES ... III REMERCIEMENTS ... IV TABLE DES MATIERES ... XII LISTE DES ABREVIATIONS ... XVII LISTE DES FIGURES ... XIX TABLE DES PHOTOGRAPHIES ... XXI LISTE DES TABLEAUX ... XXII
INTRODUCTION ... 1
I. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ... 5
I.1. Les testicules ... 6
I.1.1. Structure des testicules ... 6
I.1.2. Fonction des testicules ... 8
I.1.2.1. Fonction endocrine ... 8
I.1.2.1.1. Espace interstitiel --- 8
I.1.2.1.2. Cellules de Leydig --- 8
I.1.2.1.3. Biosynthèse de la testostérone --- 9
I.1.2.1.4. Rôles de la testostérone --- 12
I.1.2.2. Fonction exocrine ... 13
I.1.2.2.1. Structure et fonctions des tubes séminifères --- 13
I.1.2.2.2. Cellules de Sertoli --- 13
I.1.2.2.3. Biosynthèse des spermatozoïdes --- 14
I.1.3. Les principales pathologies testiculaires ... 14
I.1.3.1. Cryptorchidie ... 14
I.1.3.2. Hypospadias ... 17
I.1.3.3. Cancers testiculaires ... 19
I.2. La Spermatogenèse ... 20
I.2.1. Définition ... 20
I.2.2. Les phases de la spermatogenèse ... 20
I.2.2.1. Le renouvellement et la prolifération des cellules germinales ... 20
I.2.2.2. Phase de maturation et de différenciation cellulaire ... 21
I.2.2.3. Spermiogenèse ... 21
XIII
I.2.3. Régulation de la spermatogenèse ... 23
I.2.3.1. Régulation hormonale ... 23
I.2.3.1.1. Les gonadotrophines Hypophysaires --- 23
I.2.3.1.2. La testostérone --- 24
I.2.3.2. Contrôle par les facteurs non stéroïdiens ... 25
I.2.3.2.1. Androgen Binding Protein--- 25
I.2.3.2.2. Les cytokines --- 26
I.2.3.2.3. Les facteurs de croissance --- 26
I.3. Le stress oxydant ... 27
I.3.1. Définition ... 27
I.3.2. Les espèces réactives de l’oxygène ... 27
I.3.2.1. Définition et classification ... 27
I.3.2.2. Les principales espèces réactives d’oxygène ... 28
I.3.2.3. Sources de production des espèces réactives d’oxygène ... 29
I.3.2.3.1. Sources endogènes --- 30
I.3.2.3.2. Sources exogènes --- 30
I.3.3. Effets pathologiques du stress oxydant ... 33
I.3.3.1. La peroxydation lipidique ... 33
I.3.3.2. Oxydation des protéines ... 33
I.3.3.3. Dommages des acides nucléiques ... 34
I.3.4. Les mécanismes de défense contre le stress oxydant ... 36
I.3.4.1. Les antioxydants enzymatiques ... 36
I.3.4.1.1. La Superoxyde Dismutase --- 36
I.3.4.1.2. La Catalase --- 37
I.3.4.1.3. Le Glutathion Peroxydase --- 37
I.3.4.2. Les antioxydants non enzymatiques ... 38
I.3.4.2.1. L’acide ascorbique --- 38
I.3.4.2.2. Vitamine E --- 38
I.3.4.2.3. Le zinc --- 39
I.4. Les métaux lourds ... 40
I.4.1. Propriétés physico-chimiques du plomb ... 40
I.4.2. Le plomb dans l’environnement ... 42
I.4.2.1. Historique de l’utilisation ... 42
I.4.2.2. Pharmacocinétique du plomb ... 42
XIV
I.4.2.2.1. Absorption. --- 42
I.4.3. Principaux effets toxiques sur la santé humaine ... 45
I.4.3.1. Effets du plomb sur la biosynthèse des hormones sexuelles ... 45
I.4.3.2. Effets du plomb sur les spermatozoïdes et leur pouvoir fécondant ... 45
II. MATERIEL ET METHODES ... 47
II-1- Type et cadre d’étude ... 48
II.2. Matériel ... 48
II.2.1. Matériel biologique ... 48
II.2.2. Matériel technique ... 49
II.2.3. Réactifs et solutions ... 50
II.3. Méthodes ... 53
II.3.1. Préparation des solutions ... 53
II.3.1.1. L’acétate de plomb ... 53
II.3.1.2. Le Chlorure de Sodium 0,9% ... 53
II.3.1.3. Le Formol physiologique ... 53
II.3.1.4. L’éosine alcoolique 0,5% ... 53
II.3.1.5. L’Hydroxyde de Sodium 0,1M ... 53
II.3.1.6. Le tampon phosphate de sodium ... 54
II.3.1.7. Hématoxyline de Mayer ... 54
II.3.1.8. La solution de Diéthyl Pyrocarbonate 0,1% ... 54
II.3.1.9. Microwave solution ... 54
II.3.1.10. La solution Dénaturante ... 54
II.3.1.11. La solution de travail ... 55
II.3.2. Exposition des rats ... 55
II.3.2.1. Répartition des animaux ... 55
II.3.2.2. Marquage des animaux ... 55
II.3.3. Constitution des échantillons biologiques ... 55
II.3.4. Analyse de l’évolution du poids corporel et testiculaire ... 56
II.3.5. Evaluation des paramètres spermatiques ... 58
II.3.5.1. Evaluation de la vitalité des spermatozoïdes ... 58
II.3.5.2. Evaluation de la motilité des spermatozoïdes ... 58
II.3.5.3. Numération des spermatozoïdes ... 59
II.3.5.4. Evaluation des anomalies spermatiques ... 59
II.3.6. Préparation des broyats testiculaires ... 59
XV
II.3.7. Constitution des échantillons sanguins ... 60
II.3.8. Dosage du plomb et du zinc ... 60
II.3.9. Dosage des hormones sexuelles ... 60
II.3.9.1. Dosage des hormones hypophysaires ... 61
II.3.9.2. Dosage de la testostérone ... 61
II.3.10. Analyses des paramètres biochimiques ... 62
II.3.10.1. Dosage du cholestérol total sérique et intratesticulaire ... 62
II.3.10.2. Dosage des lipoprotéines ... 62
II.3.11. Evaluation de la peroxydation lipidique ... 63
II.3.12. Histologie des testicules ... 63
II.3.13. Mise en évidence du phénomène d’apoptose ... 66
II.3.13.1. Principe de la réaction ... 66
II.3.13.2. Réalisation de la méthode de TUNEL ... 66
II.3.14. Méthode d’extraction de l’ARN ... 67
II.3.14.1. Traitement du matériel ... 67
II.3.14.2. Phase d’extraction ... 67
II.3.15. Evaluation de l’expression des enzymes antioxydants ... 69
II.3.15.1. Quantification de l’ARN ... 69
II.3.15.2. Evaluation de l’intégrité de l’ARN ... 71
II.3.15.3. Préparation du gel d’Agarose --- 71
II.3.16. Evaluation des gènes par RT-PCR ... 71
II.3.16.1. Principe ... 71
II.3.16.2. Réalisation de la RT-PCR ... 71
II.3.17. Analyses statistiques ... 75
III. RESULTATS ... 76
III.1. Effets du plomb sur l’évolution pondérale ... 77
III.2. Effets du plomb sur les testicules. ... 80
III.2.1. Effets du plomb sur le poids des testiculaires ... 80
III.2.2. Effets du plomb sur la structure testiculaire ... 82
III.2.3. Effets du plomb sur la spermatogenèse ... 84
III.3. Effets du plomb sur les paramètres spermatiques ... 86
III.3.1. Effets du plomb sur la vitalité des spermatozoïdes ... 86
III.3.2. Effets du plomb sur la motilité des spermatozoïdes ... 86
III.3.3. Effets du plomb sur la densité des spermatozoïdes ... 86
XVI
III.3.4. Effets du plomb sur la morphologie des spermatozoïdes ... 86
III.4. Effets du plomb sur les hormones sexuelles ... 94
III.5. Effets du plomb sur les paramètres biochimiques ... 99
III.6. Dosage du plomb et du zinc dans le sérum et les homogénats testiculaires ... 104
III.7. Evaluation de la peroxydation lipidique ... 108
III.8. Mise en évidence du phénomène d’apoptose ... 110
III.9. Effets du plomb sur l’expression des enzymes et gènes ... 113
IV. DISCUSSION ... 117
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ... 126
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 129 PUBLICATIONS TIREES DE LA THESE
COMMUNICATIONS AFFICHEES ISSUES DE LA THESE ANNEXES
XVII
LISTE DES ABREVIATIONS
ADNc : ADN complémentaire ARNm : ARN messager ATP : Adénosine triphosphate C : Contrôles
CAT : Catalase
CHU : Centre Hospitalier Universitaire DEPC : Diéthyl Pyrocarbonate
DHT : Dihydrotestostérone E : Exposés
EA : Eosine-alcolique
EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid EGF : Epidermal growth factor
ENS : Ecole Normale Supérieure ERO : Espèces Réactives d’Oxygène Eth : Ethanol
GPx : Gluthation peroxydase
hCG : gonadotrophine chorionique humaine HDL : High density lipoprotein
HE : Hématoxyline de Harris IGF-1 : Insulin-like growth factor-1 IL-1β : Interleukin-1β
IPCI : Institut Pasteur de Côte d’Ivoire ABP : Androgen Binding Protein AR : Androgen receptor
XVII I
LDL : Low density lipoprotein LH : Hormone Lutéinisante LPO : La peroxydation lipidique MDA : Malondialdéhyde
OG : Orange G
OMS : Organisation Mondiale de la Santé PBDE : PolyBromodiPhénylEther
PBR : Peripheral benzodiazepine receptor PM: Marqueur de poids moléculaire
RT-qPCR : transcription inverse quantitative SAA : Spectrométrie d’Absorption Atomique SO : Stress oxydant
SOD : Super Oxyde Dismutase SPZ: Spermatozoïde
StAR : Steroidogenesis activator protein TBE : Tris Borate EDTA
TGF-β1 : Transforming growth factor-β1 TNFα : Tumor necrosis factor
TS : Tubes séminifères
Tunel : Terminal deoxynuleotidyl transferase dUTP Nick End Labelling UFR : Unité de Formation et de Recherche
Xyl : Xylène
XIX
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Structure des testicules chez l’homme (Bonnes et al., 1998) ... 7
Figure 2: Biosynthese de la testosterone (Tostain et al. 2004) ... 11
Figure 3: Differents types de cryptorchidie (Ludwig, 2011) ... 16
Figure 4A: Les etapes de la spermatogenese (Bujan et al., 1988). ... 22
Figure 4B : Les etapes de la spermiogenese (Blanc et al., 1988). ... 22
Figure 5: Sources des ero et leurs effets sur la fertilite masculine (Renato et aL., 2012) ... 32
Figure 6: Dommages de l’adn causes par les ero (FAVIER, 2003). ... 35
Figure 7B : Les etapes de la coloration a l’hematoxyline-eosine (PCD, 1999) ... 65
Figure 8: Les etapes du dosage de l’ARN (qubit® assays man 0010876 REV. A.O.) ... 70
Figure 9 : Effets du plomb sur la croissance corporelle des rats ... 78
Figure 10 : Effets du plomb sur la consommation journaliere d’eau des rats ... 79
Figure 11A : Effets du plomb sur le poids absolu des testicules des rats ... 81
Figure 11B : Effets du plomb sur le poids relatif des testicules des rats... 81
Figure 12: Effets du plomb sur la vitalite des spermatozoïdes des rats ... 88
Figure 13 : Effets du plomb sur la motilite des spermatozoïdes ... 89
Figure 14 : Effets du plomb sur la densite des spermatozoïdes ... 91
Figure 15 : Effets du plomb sur la morphologie des spermatozoïdes ... 93
Figure 16A : Effets du plomb sur la concentration de la testosterone serique ... 96
Figure 16B : Effets du plomb sur la concentration de la testosterone testiculaire ... 96
Figure 17A: Effets du plomb sur la concentration de la fsh serique ... 97
Figure 17B: Effets du plomb sur la concentration de la fsh testiculaire ... 97
Figure 18A : Effets du plomb sur la concentration de la lh serique ... 98
Figure 18B : Effets du plomb sur la concentration de la lh testiculaire ... 98
Figure 19 A : Effets du plomb sur la teneur en cholesterol dans le serum ... 101
Figure 19B: Effets du plomb sur la teneur en cholesterol dans les testicules ... 101
Figure 20A : Effets du plomb sur la teneur en HDL dans le serum ... 102
Figure 20B : Effets du plomb sur la teneur en HDL dans les testicules ... 102
Figure 21A : Effets du plomb sur la teneur en LDL dans le serum ... 103
Figure 21B : Effets du plomb sur la teneur en LDL dans les testicules ... 103
Figure 22A : Teneur en pb dans le serum des rats ... 106
Figure 22B : Teneur en pb dans les homogenats testiculaires des rats ... 106
Figure 23A : Teneur en zinc dans le serum des rats... 107
XX
Figure 23B : Teneur en zinc dans les homogenats testiculaires ... 107
Figure 24A : Effets du plomb sur la teneur du mda dans le serum ... 109
Figure 24B : Effets du plomb sur la teneur du mda dans les testicules ... 109
Figure 25 : Effet du plomb sur la mort cellulaire par apoptose... 112
Figure 26 : Effets du plomb sur l’expression des enzymes antioxydants ... 115
Figure 27 : Effets du plomb sur l’expression des gènes anti et pro-apoptotiques ... 116
XXI
LISTE DES PHOTOGRAPHIES
Photographie 1: Exemples d’hypospadias chez l’homme : (a) Anterieure (b) Coronale (c) Distale (wang et al., 2008). ... 18 Photographie 2 : Testicules des rats de l’etude (KONAN, 2016) ... 57 Photographie 3 : Coupes histologiques presentant les structures testiculaires ... 83 Photographie 4 : Coupes transversales presentant la spermatogenese chez les rats ... 85 Photographie 5: Micrographie presentant la densite spermatiques des rats ... 90 Photographie 6: Micrographie presentant les anomalies spermatiques chez les rats ... 92 Photographie 7 : Mise en evidence des cellules apoptotiques chez les rats ... 111 Photographie 8: Photographie du gel des echantillons d’arn des rats ... 114
XXII
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I: Principales proprietes physico-chimiques du plomb (Pascal, 1963) ... 41 Tableau II A: Sequences des amorces antioxydants utilisees ... 52 Tableau II B: Sequences des amorces pro et anti-apoptotiques utilisees ... 52 Tableau III : Composition du melange reactionnel ... 73 Tableau IV: Programmes d’amplification des sequences ... 74 Tableau V: Effets du plomb sur les parametres spermatiques ... 87 Tableau VI A: Effets du plomb sur les hormones sexuelles seriques des rats ... 95 Tableau VI B: Effets du plomb sur les hormones sexuelles testiculaires des rats ... 95 Tableau VII A: Effets du plomb sur les parametres biochimiques dans le serum ... 100 Tableau VII B: Effets du plomb sur les parametres biochimiques dans les testicules ... 100 Tableau VIII A: Teneur en plomb dans le serum et les testicules des rats ... 105 Tableau VIII B: Teneur en zinc dans le serum et les testicules des rats ... 105
1
INTRODUCTION
2
Des données épidémiologiques récentes concluent qu’environ 15% des couples sont confrontés à des difficultés pour avoir des enfants et sont amenés à consulter un médecin pour ce problème (Trussell, 2013).
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), dans environ la moitié de ces cas, un facteur masculin est en cause (WHO, 2010) et des altérations quantitatives et/ou qualitatives des spermatozoïdes sont généralement présentes.
Ces dernières décennies sont ainsi marquées par le débat sur la qualité du sperme (Nelson et Bunge, 1974 ; Geoffroy-Siraudin et al. 2012). Selon Carlsen et al. (1992), la concentration de spermatozoïdes dans le sperme déclinerait jusqu’à 50% ces dernières années.
En outre, 30 à 40 % des hommes infertiles ont des niveaux élevés d’Espèces Réactives d’Oxygène (ERO) dans le liquide séminal (Lanzafame et al. 2009). Parallèlement, la fréquence des affections de l’appareil reproducteur mâle a augmenté chez l’espèce humaine (Adami et al. 1994). De même, des anomalies du système reproducteur de plusieurs espèces de poissons de rivières ont également été mises en évidence, ainsi que des effets sur la reproduction de certains reptiles et gastéropodes (Backlin et al. 2003 ; Gunderson et al. 2004
; Bredhult et al. 2008).
Plusieurs études expérimentales et observations ont suggéré que ces altérations de la fonction de reproduction mâle pourraient être dues à des facteurs toxiques présents dans notre environnement. Elles ont plus particulièrement incriminé des molécules d’origine industrielle ou anthropogénique regroupées sous le terme générique de perturbateurs endocriniens (Ferreira, 2010).
Ainsi, de nombreux groupes de recherche se sont intéressés aux effets potentiellement toxiques de divers agents chimiques et physiques de notre environnement sur la fertilité humaine (Toppari et al. 1996).
Parmi les polluants mis en cause, figurent de nombreux xénobiotiques tels que les solvants, les pesticides et les métaux lourds etc. Ils sont suspectés d’être responsables de la baisse de la fertilité masculine et féminine observée au cours de ce dernier siècle (Gorbel et al., 2002).
Ces substances environnementales qui ont la capacité de mimer ou d’antagoniser les hormones naturelles attirent l’attention de la communauté scientifique, désireuse d’établir un lien entre l’exposition à de tels composés et l’apparition des effets délétères observés sur la reproduction.
3
Ainsi, il nous est apparu important d’explorer la toxicité des métaux lourds singulièrement celle du plomb (Pb), étant donné l’abondance de ses sources ainsi que sa répartition (canalisations d’eau, pollution industrielle, trafic automobile…) et la possible bioconcentration de ce métal dans le plasma séminal (Kunari et al., 2000) ou le liquide folliculaire (Pasky et al., 2000).
Des études essentiellement d’ordre clinique et épidémiologique, réalisées chez des ouvriers exposés au plomb au cours de leur travail et chez des policiers ou des chauffeurs de taxi, ont mis en évidence une baisse de la fertilité féminine et du nombre de grossesses, une diminution de la fertilité masculine associée à une diminution du nombre et de la motilité des spermatozoïdes et à une réduction du volume du liquide séminal (Apostoli et al., 1998).
Par ailleurs, les études menées par Konan et al. (2016) ont permis de mettre en évidence la présence de plomb et de cadmium dans les éjaculats de patients consultant pour infertilité masculine à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire (IPCI).
Toutefois, les conclusions de ces études sont souvent contradictoires, du fait de l’hétérogénéité des populations étudiées (tabagisme, habitudes alimentaires, patrimoine génétique…) et de l’environnement dans lequel de nombreux facteurs peuvent agir en synergie (Sitarek et al., 1998).
Aussi, les études réalisées in vitro ne permettent pas d’expliquer le mécanisme d’action de ces polluants environnementaux sur la fertilité, comme s’accordent à le dire de nombreux experts internationaux (Spielman, 1998) vu que les résultats de ces recherches n’intègrent pas les mécanismes complexes de régulation hormonale de l’organisme.
En outre, des motifs évidents, relevant de l’éthique médicale, rendent difficiles les études moléculaires portant sur la fertilité humaine (Teletin et al., 2011).
Les souris ou les rats apparaissent dans ce cas comme d’excellents modèles pour appréhender les problèmes de fertilité dans l’espèce humaine, car la mise en place de la spermatogenèse à la puberté ainsi que son déroulement chez l’adulte sont similaires chez ces rongeurs et chez l’homme (Teletin et al., 2011).
Les testicules, organes clés de la fonction de reproduction mâle, lieu de synthèse des hormones sexuelles et de la spermatogenèse, représentent donc une cible privilégiée pour les perturbateurs de la fonction de reproduction mâle (Ludwig, 2011).
Dans ce cadre, et afin de préciser les effets du plomb sur les fonctions de reproduction masculine, nous nous sommes proposés d’explorer les effets cytotoxiques du plomb sur la fonction sexuelle endocrine et exocrine chez les rats mâles pubères.
4
Pour atteindre cet objectif; les objectifs spécifiques ci-dessous ont été assignés:
- Evaluer les effets du plomb sur les paramètres spermatiques et sur les hormones sexuelles mâles.
- Déterminer les effets du plomb sur les marqueurs oxydatifs.
- Evaluer les effets du plomb sur le phénomène de l’apoptose.
Ce manuscrit est subdivisé en cinq parties:
Dans la première partie, portant sur la revue bibliographique, les généralités sur les testicules, la spermatogenèse et le stress oxydant, sont décrits, suivent des données non exhaustives de la littérature sur le plomb ainsi que ses effets sur les fonctions de reproduction mâle.
Dans la seconde partie est consacrée à la description du matériel et à l’expérimentation proprement dite.
Les principaux résultats obtenus sont exposés dans la troisième partie; et la quatrième, consacrée à la discussion qui en découle.
Enfin, après une conclusion générale suivie de perspectives, le manuscrit se termine par la présentation des références bibliographiques support de réalisation de cette étude.
5
I. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
I. REVUE
BIBLIOGRAPHIQUE
6
I.1. Les testicules
Afin de comprendre la physiologie du testicule, dans la première partie, la fonction endocrine sera d’abord présentée via la description des espaces interstitiels et des cellules de Leydig, siège de la stéroïdogenèse. Ensuite, la biosynthèse de la testostérone sera détaillée suivie d’une revue de la littérature sur les fonctions de cette hormone.
Dans la seconde partie, la fonction exocrine sera exposée au travers de la description des tubes séminifères et leprocessus de la spermatogenèse qui s’y déroule sera abordé au chapitre suivant.
Les cellules de Sertoli compte tenu de leur rôle majeur dans le soutien des cellules germinales au cours de la spermatogenèse seront également abordées. Enfin, cette partie sera close par les principales pathologies testiculaires.
I.1.1. Structure des testicules
Le testicule est un organe pair de forme ovale localisé dans la bourse, dont le revêtement cutané est le scrotum (Figure 1). Chaque testicule est suspendu dans le sac scrotal par le cordon spermatique. Ce dernier est constitué du canal déférent, des vaisseaux sanguins et lymphatiques ainsi que des fibres nerveuses.
Le testicule est recouvert de deux tuniques. La tunique superficielle ou tunique vaginale, est formée de deux feuillets et dérive du péritoine. La tunique la plus profonde est l’albuginée, une capsule de tissu conjonctif fibreux. Des projections de l’albuginée forment les cloisons du testicule, qui divisent celui-ci en 200 voire 300 compartiments appelés lobules.
Chaque lobule renferme un à quatre tubes séminifères hautement enroulés (Ragini et Umesh, 2011). Ce sont dans ces tubes que se divisent et se différencient les cellules germinales jusqu'à la formation des spermatozoïdes.
7
Figure 1: Structure des testicules chez l’homme (Bonnes et al., 1998)
8
I.1.2. Fonction des testicules
Le testicule est l'organe principal du développement sexuel masculin et de la fertilité masculine (Wilhelm et al. 2007). Il sécrète des hormones pour promouvoir les traits spécifiques aux hommes (fonction endocrine) et produit les spermatozoïdes pour la reproduction (fonction exocrine).
I.1.2.1. Fonction endocrine
La fonction endocrine des testicules est la synthèse des androgènes dont l’essentiel est la testostérone. A cet effet, une revue de la littérature sur l’espace interstitiel, la structure et le rôle des cellules de Leydig sera exposée avant la biosynthèse et les fonctions de la testostérone.
I.1.2.1.1. Espace interstitiel
Les tubes séminifères dans lesquels se déroule la spermatogenèse sont séparés par un tissu conjonctif dénommé espace interstitiel. L’espace interstitiel contient plusieurs types de cellules et composants que sont : les cellules de Leydig, les cellules péritubulaires, les macrophages, les artérioles et les fibroblastes (Leeson, 1963).
› Les cellules de Leydig sont les cellules majoritaires de l’interstitium chez le rat. Elles représentent moins de 5% des cellules du testicule. Elles sécrètent des androgènes essentiellement sous forme de testostérone, de Dihydrotestostérone (DHT) ainsi que des œstrogènes. L’activité de ces cellules est sous le contrôle de l’hormone lutéinisante (LH) antéhypophysaire (Haider, 2004) ;
›Les cellules péritubulaires myoïdes (PM) relayent quelques effets de la testostérone, ainsi que d’autres hormones et facteurs de croissance sur les cellules de Sertoli et les cellules germinales (Maekawa et al., 1996).
I.1.2.1.2. Cellules de Leydig
La cellule de Leydig a été décrite pour la première fois en 1850 par Franz Leydig.
Mais il a fallu attendre en 1903 pour que Bouin et Ancel apportent les premiers éléments montrant que la cellule de Leydig est une cellule glandulaire endocrine, contrôlant le développement des caractères sexuels secondaires mâles (Ludwig, 2011).
La cellule de Leydig est une cellule polygonale au noyau ovoïde proéminent. Elle possède une ultrastructure caractéristique des cellules synthétisant des stéroïdes à savoir cytoplasme riche en citernes de réticulum endoplasmique lisse, mitochondries de taille
9
variable et peu nombreuses garnies de crêtes généralement lamellaires, et enclaves lipidiques abondantes dans le cytoplasme des cellules matures.
Les cellules de Leydig sont soit isolées, soit groupées en amas autour des capillaires sanguins, et entourées par une lame basale discontinue. La proximité de ces cellules avec les tubes séminifères facilite la sécrétion de fortes concentrations de testostérone, qui sont nécessaires à l’initiation et au maintien de la spermatogenèse (Kerr, 1992).
Dans la plupart des espèces, deux générations de cellules de Leydig ont été décrites au cours du développement :
Une population fœtale qui, sous l’influence stimulatrice de la gonadotrophine chorionique humaine (hCG), produit de la testostérone au cours du développement fœtal, essentielle à la formation des gonades mâles et des progéniteurs, à la différenciation et à la morphogénèse du tractus génital mâle et enfin à la masculinisation et à la différenciation sexuelle au niveau du système nerveux central.
Une génération adulte dont la production de testostérone est stimulée par la LH à partir de la puberté, et permet le maintien de la spermatogenèse et des caractères sexuels secondaires mâles (Habert et al., 2001).
I.1.2.1.3. Biosynthèse de la testostérone
Un androgène est une hormone stéroïdienne capable d’induire la différentiation et la maturation des organes reproducteurs masculins, de stimuler les caractères sexuels secondaires pour aboutir à un phénotype masculin normal (Mooradin et al., 1987) et d’entraîner les modifications comportementales nécessaires au rôle de l’homme dans la reproduction (Brown et al., 2003).
Le principal androgène circulant est la testostérone (Tostain et al., 2004). Elle est produite essentiellement (plus de 95%) par les cellules de Leydig du testicule, situées autour et entre les tubes séminifères, qui représentent 5% du volume de la glande (Schulze, 1984).
La cellule de Leydig présente dans le testicule est le seul type cellulaire qui possède l'ensemble des enzymes nécessaires à la synthèse des hormones sexuelles stéroïdiennes (Ewing et Zirkin, 1983).
Le cholestérol est le précurseur des androgènes (Tostain et al., 2004). Il est le substrat utilisable pour la biosynthèse des stéroïdes, peut provenir de différentes sources (Benahmed et al., 1983).
10
Il peut être fourni par les lipoprotéines circulantes telles que HDL et LDL respectivement high density lipoprotein and low density lipoprotein (Gwynne et Strauss, 1982) mais aussi par des membranes cellulaires. Dans les espèces humaine et porcine, il provient majoritairement de l’endocytose des esters de cholestérol contenus dans les lipoprotéines de basse densité ou LDL (Ludwig, 2011). Le cholestérol (C27) est transporté vers les mitochondries par un mécanisme dépendant de la LH et régulé par une protéine de transfert dite protéine activatrice de la stéroïdogénèse (StAR ou steroidogenesis activator protein) (Stocco, 1997). Ce transfert intra-mitochondrial du cholestérol est l’étape limitante de la stéroïdogenèse. Le PBR (peripheral benzodiazepine receptor) y participe de façon minoritaire (Li et Papadopoulos, 1998).
Dans la mitochondrie, le début de la cascade de la stéroïdogenèse est marqué par le clivage du cholestérol (C27) en prégnénolone (C21) par le cytochrome P450scc (side-chain clivage). La prégnénolone, biologiquement inactive, est éjectée dans le réticulum endoplasmique où elle est métabolisée, notamment sous l’action d’enzymes oxydatifs du groupe des cytochromes P450. La prégnénolone est alors convertie en une variété de stéroïdes C19.
Il existe deux voies d’obtention de la testostérone (Brock et Waterman, 1999) qui diffèrent selon les espèces. Ces voies sont désignées sous les termes de voie D4 ou D5, suivant que les composés intermédiaires sont respectivement 3-céto, D4 stéroïdes ou 3- hydroxy, D5 stéroïdes. La voie D5 qui fait intervenir en premier P450 C17 qui est codé par le gène CYP17 est la voie préférentielle dans le testicule humain (Zuber et al., 1986) dont l’expression est sous le contrôle de la LH. Sur cette voie, le premier composé intermédiaire est la 17α-hydroxyprégnénolone. Le clivage de la chaîne latérale fait apparaître le premier stéroïde C19, la déhydroépiandrostérone (DHEA). L’action du complexe 3ß-hydroxystéroide déshydrogénase/ D5-D4-isomérase (3ßHSD) la transforme en D4-androstènedione, puis celle de la 17ß-hydroxystéroide déshydrogénase (17ßHSD réduisant le groupe cétonique 17 en OH) aboutit à la formation de la testostérone. La voie D4, accessoire, fait intervenir en premier le complexe 3b-hydroxystéroïde déshydrogénase D5-D4-isomérase pour former la progestérone qui est hydroxylée en 17a-hydroxyprogestérone. L’action de clivage de P450C17 la transformera en D4-androstènedione, premier C19 de cette voie minoritaire.
11
Figure 2: Biosynthèse de la testostérone (Tostain et al. 2004)
12
I.1.2.1.4. Rôles de la testostérone
La testostérone est une hormone multi-fonctionnelle (Mainwaring et al. 1988). Le contenu en testostérone du testicule de l’homme adulte est d’environ 1 μg/g de testicule (Winters et al. 2003). Selon Tostatin et al. (2004), la concentration de la testostérone dans les testicules serait comprise entre 100 et 600 ng/mL et serait approximativement 75 fois plus élevée que celle du sang (3-10 ng/mL).
La testostérone agit localement par fixation directe à l’androgen receptor (AR) au niveau du testicule sur les cellules de Sertoli, afin de participer à la régulation de la spermatogenèse. Elle permet aussi la différenciation, la croissance et le fonctionnement des organes reproducteurs (Wang et al. 2009; Verhoeven et al., 2010).
A la puberté, la testostérone provoque le début de la spermatogenèse, et cible tous les organes annexes, les conduits, le glande et le pénis, qui croissent et assument leurs fonctions adultes. Plus spécifiquement, cette hormone intervient dans la progression de la spermatogenèse et l’achèvement de la méïose (Wang et al. 2009), dans le maintien de l’intégrité de la barrière hémato-testiculaire, dans la formation des connections entre les cellules de Sertoli et l’adhésion des cellules de Sertoli/spermatides, ainsi que dans le relargage des spermatozoïdes matures (Chang et al. 2004 ; Holdcraft et al., 2004 ; Wang et al., 2006).
La testostérone est également responsable du développement et du maintien des caractères sexuels secondaires masculins. Ces caractères apparaissent à la puberté, qui est marquée par l’apparition des poils pubiens, axillaires et faciaux, ainsi que par l’augmentation de la croissance des poils de la poitrine. La peau s’épaissit et devient plus grasse, les os croissent et leur densité augmente, et les muscles squelettiques sont plus gros et plus lourds.
Chez les hommes adultes, la concentration normale de la testostérone est nécessaire à l’entretien des organes sexuels : si la testostérone est absente ou pas assez abondante, les organes annexes s’atrophient, le volume du sperme diminue fortement, puis l’érection et l’éjaculation deviennent impossibles.
La testostérone accélère aussi la vitesse du métabolisme basal, stimule l’érythropoïèse, et influe sur le comportement. Elle constitue également la base de la pulsion sexuelle chez les hommes et les femmes (Bain, 2007).
Enfin, la testostérone exerce sa propre régulation par un mécanisme de rétrocontrôle sur l’hypothalamus et l’adénohypophyse (Ludwig, 2011).
13
I.1.2.2. Fonction exocrine
I.1.2.2.1. Structure et fonctions des tubes séminifères
Les tubes séminifères sont les principaux composants structurels des testicules. Ils constituent des barrières physiques et fournissent des nutriments pour la survie et la maturation des spermatozoïdes.
Les tubes séminifères sont formés à partir d'épithéliales comme les cellules de Sertoli, ainsi que les myofibroblaste peritobulular myoïde (PM), cellules à la périphérie. Pendant le développement des testicules, les cellules de Sertoli et les cellules PM sécrètent des extracellulaires spécifiques, des protéines matricielles, et assemblent une couche de membrane basale (Tung et al., 1984a) pour séparer les tubules séminifères de l'espace interstitiel, où résident les cellules de Leydig, les cellules endothéliales et d'autres cellules mésenchymateuses non identifiées (Ludwig, 2011).
Les tubes séminifères sont de longues structures à l'intérieur des testicules, délimitées par une gaine tubulaire mince (lamina propria) formée de la membrane basale, de fibroblastes, de fibres de collagène et de cellules myoïdes (Holstein et al., 2003). Ces dernières cellules, de par leur activité contractile, participent à l'évacuation des spermatozoïdes non mobiles dans le testicule.
I.1.2.2.2. Cellules de Sertoli
C'est en 1865 qu’Enrico Sertoli décrivit pour la première fois les cellules qui portent aujourd'hui son nom. Dès 1871, ce chercheur italien reconnut la fonction nourricière et sécrétoire de ces cellules somatiques, fonction dont le rôle central est aujourd’hui connu dans le contrôle du processus spermatogénique (Ludwig, 2011).
Ce sont des cellules cylindriques s’étendant de la partie basale jusqu’à la lumière du tube séminifère. On en dénombre environ 4. 107 par testicule chez le rat adulte (Russel et al.
1993). Le noyau de la cellule de Sertoli, situé du côté basal du tube séminifère, est irrégulier avec de profonds replis, mais tend à prendre une forme ovale. Sa chromatine est fine et son nucléole bien visible, caractéristique de cellules à activité métabolique élevée.
Le cytoplasme contient du réticulum endoplasmique lisse et rugueux, des mitochondries, des lysozymes, des gouttelettes lipidiques, un appareil de Golgi bien développé et un riche cytosquelette (Russel et al., 1993 ; Mruk et Cheng, 2004).
14
Leur forme irrégulière, via l’existence de nombreuses expansions cytoplasmiques ramifiées, permet d’enserrer les cellules germinales en développement. Ces cellules germinales et les cellules de Sertoli sont donc extrêmement enchevêtrées et en communication permanente.
Le ratio est d'une cellule de Sertoli pour 50 cellules germinales au sein du testicule de rat adulte. Les cellules de Sertoli voient leur structure varier au cours du cycle de l’épithélium séminifère, de manière à optimiser l’adhérence des cellules germinales avec lesquelles elles sont en contact, et ainsi permettre leur mouvement.
Deux types de cellules de Sertoli peuvent être décrits : cellule Sertoli de type A présentant des cryptes cytoplasmiques dans lesquelles se trouvent les spermatides matures prêtes à être relarguées dans la lumière du tube séminifère, et cellule de Sertoli de type B chez lesquelles les cryptes sont peu visibles voire absentes.
I.1.2.2.3. Biosynthèse des spermatozoïdes
La production des spermatozoïdes par les testicules sera abordée dans le second chapitre consacré essentiellement à la spermatogenèse.
I.1.3. Les principales pathologies testiculaires I.1.3.1. Cryptorchidie
Au cours de la vie fœtale, le testicule subit un mouvement de descente, passant d’une position abdominale à une position scrotale (Scorer et al., 1964). En cas de non descente du testicule dans le scrotum, on parle de cryptorchidie (Figure 3).
Dans le cas de testicules non descendus, il est habituel de distinguer deux aspects anatomiques : (i) les testicules cryptorchides vrais, en arrêt sur leur trajet de migration, qui peuvent selon le niveau de cet arrêt, être abdominaux, intracanalaires, ou se situer en aval de l’orifice inguinal superficiel ; ou (ii) les testicules cryptorchides ectopiques, plus rares, qui se définissent par la présence du testicule en dehors de son trajet normal de migration.
L’anomalie peut être également bilatérale.
Les testicules inguinaux ou intra-abdominaux seront incapables d’assurer une spermatogenèse normale, en raison d’une température plus élevée en ces endroits que celle régnant dans le scrotum.
La cryptorchidie est la plus courante des anomalies du nouveau-né. Son incidence varie de 2 à 4%.
15
L’hormono-dépendance de la descente testiculaire a conduit à suspecter le rôle des perturbateurs endocriniens (PE) dans l’augmentation de la cryptorchidie (Toppari et al., 1996). Hosie et al. (2000), ont mis en évidence un taux élevé d’organochlorés dans le tissu adipeux, chez les enfants présentés pour une chirurgie correctrice de la cryptorchidie.
Par ailleurs, un certain nombre d’études épidémiologiques corrèlent l’apparition d’anomalies du tractus génital mâle, comme la cryptorchidie, à une exposition à des pesticides (Garcia-Rodriguez et al., 1996 ; Kristensen et al.,1997).
Plusieurs perturbateurs endocriniens (PE) aux propriétés anti-androgéniques ou œstrogèniques apparaissent également responsables de phénomènes de cryptorchidie chez des animaux de laboratoire. C’est le cas de fongicides qui agissent comme antagonistes des AR (Gray et al., 2006), ou des esters de phtalates qui perturbent la biosynthèse des androgènes (Mylchreest et al., 2002; Fisher et al., 2003) et, certains métabolites issus des PolyBromodiPhénylEthers (PBDE) induisent une augmentation de l'activité de l'aromatase (Song et al., 2008), un autre mécanisme conduisant à un ratio déséquilibré androgènes/œstrogènes.
16
Figure 3: Différents types de cryptorchidie (Ludwig, 2011)
17
I.1.3.2. Hypospadias
L’hypospadias représente la seconde malformation congénitale de l’appareil reproducteur mâle la plus fréquente après la cryptorchidie, actuellement estimée à 1 pour 300 naissances masculines (Baskin et al., 2001).
Il est dû à un développement anormal du pénis sur lequel l’orifice, ou méat urétral, ne se localise pas à l’extrémité du gland pénien (Photographie 1).
Si l’anomalie d’implantation du méat urétral est l’élément définissant théoriquement l’hypospadias, il faut plutôt considérer cette anomalie comme une hypoplasie des tissus constituant la face ventrale du pénis, dans laquelle il existe une malformation de l’urètre.
Une prédisposition génétique non mendélienne à l’hypospadias existe. Toutefois, son incidence a augmenté ces dernières décennies dans la majorité des pays occidentaux, notamment en Angleterre, au Pays de Galles (Matlai et Beral, 1985), en Hongrie (Czeizel et Kovacs, 1985) ou encore en Suède (Kallen et al., 1982).
Une étude réalisée aux Etats-Unis d’Amérique a montré un doublement de la fréquence des hypospadias entre 1968 et 1993 (Paulozzi et al., 1997). Puisque la différenciation de l’urètre pénien dépend de la DHT (Dihytestostérone), le phénomène d’hypospadias peut être associé à une altération du recepeteur d’androgène (AR), et/ou du métabolisme de la testostérone.Ceci suggère donc une implication possible des perturbateurs endocriniens (Allen et al., 1984; Leung et al., 2007).
La littérature regorge d’expériences démontrant l’effet de ces substances sur le système reproducteur mâle, capables d’induire des phénomènes d’hypospadias. Cette malformation apparaît généralement chez des rats ou souris mâles, après traitement in utero par des substances: (i) à pouvoir œstrogènique, (ii) antagonisant l’AR, (iii) modulant l’activité des cytochromes P450 impliqués dans la stéroïdogenèse ou (iv) altérant la différenciation des cellules de Leydig fœtales (Gray et al., 2004).
18
Photographie 1: Exemples d’hypospadias chez l’homme : (A) antérieure (B) coronale (C) distale (Wang et al., 2008).
19
I.1.3.3. Cancers testiculaires
Le cancer du testicule est un cancer rare puisqu'il ne représente que 1 à 2 % des cancers humains néanmoins, il constitue le cancer le plus fréquent chez l’homme entre 20 et 35 ans (Ludwig, 2011).
Deux éléments majeurs caractérisent ce cancer : (i) l’âge de survenue, c’est un cancer qui touche surtout le sujet jeune ; et (ii) l’excellent pronostic, avec un taux de guérison proche de 90 % voire supérieur.
Les cancers testiculaires peuvent toucher un testicule, ou les deux. Selon les cellules atteintes, plusieurs types de cancers, possédant des différences marquées au niveau de leur pronostic (en termes de développement de la maladie et du taux de survie) et de leur traitement, sont distingués. Parmi les cancers issus des cellules germinales (95 % des cas), deux types sont généralement décrits :
Les tumeurs séminomateuses, qui représentent 30 à 40 % des cancers du testicule, sont souvent localisées dans le testicule. Elles sont constituées par la prolifération anarchique de cellules dérivées des cellules germinales et présentent un aspect histologique homogène. Ces tumeurs séminomateuses, composées d'un seul contingent séminomateux, se classent en trois catégories : (i) les séminomes typiques ou classiques (80 %) ; (ii) les séminomes anaplasiques (10 %), plus agressifs que les précédents ; et (iii) les séminomes spermatocytaires.
Les tumeurs non séminomateuses (tumeurs embryonnaires) représentent 60 à 70 % des tumeurs testiculaires. Elles ne sont localisées au niveau du testicule que dans 30 % des cas uniquement. Plusieurs types histologiques sont regroupés dans ce cadre et peuvent être retrouvés, isolés ou associés, au sein d'une même tumeur. Elles comprennent les carcinomes embryonnaires, les tumeurs du sac vitellin (souvent observées chez les enfants de moins de 5 ans), les choriocarcinomes, les tératomes, et les polyembryomes. Un autre type a également été décrit : les tumeurs mixtes. Elles sont souvent composées de plusieurs contingents. Ces tumeurs mixtes peuvent également être une fusion de composants séminomateux et non- séminomateux (Gori et al., 2005).
20
I.2. La Spermatogenèse I.2.1. Définition
La spermatogenèse est le processus de différenciation cellulaire qui aboutit à la transformation des cellules germinales en spermatozoïdes (Faure, 2007). Elle débute à la puberté et se poursuit tout au long de la vie adulte.
Elle se déroule dans les parois des tubes séminifères des testicules. La durée de la spermatogenèse varie selon les espèces, elle est de 35 jours chez la souris, 52 jours chez le rat et de 74 jours chez l’homme (Clermont, 1972).
I.2.2. Les phases de la spermatogenèse
Selon Walker (2010), la spermatogenèse comporte trois phases qui sont chronologiquement: le renouvellement et la prolifération des cellules de la lignée germinale, la maturation et la différenciation cellulaire et, enfin de la spermiogenèse (Figure 4A). Ces phases impliquent des types de cellules germinales différents (Holstein et al., 2003; Hermo et al., 2010).
I.2.2.1. Le renouvellement et la prolifération des cellules germinales
La spermatogenèse débute par les spermatogonies, cellules germinales diploïdes présentent dès les premiers jours de la vie embryonnaire. Clermont (1963), en a identifié trois types; les spermatogonies Ad, les spermatogonies Ap et les spermatogonies B.
La première phase de la spermatogenèse repose sur une mitose classique à partir de cellules germinales souches: les spermatogonies A. Parmi ces spermatogonies A, un certain nombre (spermatogonies Ad) se divise par mitose mais ne se différencie pas, permettant ainsi le maintien et le renouvellement de l’épithélium séminifère. Une autre partie de ces spermatogonies A (spermatogonies Ap) cesse de se multiplier, et se différencie en spermatogonies de type B. Les spermatogonies B se divisent par mitose et donnent naissance aux spermatocytes primaires ou spermatocytes I (Ehmcke et al., 2006; Robin et al., 2010).
