Les plasmides contenant les protéines sauvages ont été déjà disponibles au laboratoire, ceux-ci ont était utilisés comme matrice pour générer les autres constructions testées dans ce projet.
1. Amplification des gènes d’intérêts
a) La méthode PCR (pour Polymerization chain reaction)
Pour un volume final de 50 µL de milieu réactionnel : dans un tube PCR, une quantité de 50 ng de matrice est ajouté au mélange contenant 0.5 µL d’oligonucléotide 5’ (stock 100 pmol/µL Eurofin genomics), 0.5 µL d’oligonucléotide 3’ (stock 100 pmol/µL Eurofin genomics), 1 µL de dNTP (stock 10 mM) et 10 µL de tampon GC green (stock 5x thermofisher). Un volume de 0.25 µL de polymérase à ADN (Phusion) est ajouté à la réaction (2000 U/mL New england Biolab). Enfin, le volume total est ajusté avec de l’eau (qsp 50 µL).
b) Conditions PCR
Une première dénaturation à 98°C pendant 5 min est effectuée qui est suivie par un premier cycle avec une dénaturation (1 min à 98°C). Cette étape est suivie d’une hybridation pendant 30 sec avec un gradient de température (de 40 à 60 °C). L’élongation se fait à 72 °C, le temps d’élongation nécessaire est ajusté en fonction de la taille du fragment à amplifier en général entre 1 à 2 min (activité de la polymérase Phusion 500 pdb pour 30 sec). Le cycle est répété 25 fois puis la réaction est maintenue à 72°C pendant 10 min et enfin à 20°C (Figure 44).
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Les fragments amplifiés sont ensuite analysés sur gel d’agarose 1x en présence de BET (2.5 µL pour 50 mL) La migration se fait pendant 20 min à 230V dans le tampon TBE 0.5x. Les bandes sont ensuite révélées sous UV. Les réactions positives sont de nouveau chargées sur gel d’agarose 1x en présence de Sybr Green (5 µL pour 50 mL) avec les mêmes paramètres de migration cités auparavant puis les bandes d’intérêts sont coupées puis purifiées utilisant un kit d’extraction commercial (Qia prep Gel extraction Qiagen). Enfin, la concentration La concentration de l’amplicon est déterminée en mesurant l’absorbance A260 avec un spectrophotomètre Denovix DS-11+.
2. Linéarisation des vecteurs pour le clonage
Pour le projet on utilise principalement les vecteurs suivants : pET-MCN-His,
pET-MCN-His-GST pET-MCN-kan, pCDF-MCN pST31-GST-His
Les vecteurs utilisés pour ce projet sont des vecteurs dérivés du plasmide pET-28a (Romier et al., 2006) à l’exception du vecteur pST31-GST-His qui est un vecteur dérivé du plasmide pET-15b. Les cartes de chaque vecteur sont représentées dans la section ANNEXES (Figure 49 &
50).
a) Digestion à la française
Pour chaque vecteur, le mélange réactionnel suivant est préparé :
Dans un tube eppendorf 1.5 mL une quantité d’ADN d’environ 2 µg est resuspendue dans un volume de 5 µL de tampon Cutsmart 10x (New england biolabs). Le volume est ensuite ajusté à 45 µL avec de l’eau. Sur glace, trois tubes annotés A, B, et C contiennent respectivement un volume de 2.25 µL de l’enzyme 1 ; 2.25 µL de l’enzyme 2 et enfin 0.5 µL d’eau. Le mélange initial contenant le vecteur à linéariser est ensuite dispatcher dans les trois tubes annotés précédemment (A : 20.25 µL, B : 20.25 µL et C : 4.5 µL). Sur glace, on prépare de nouveau
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trois tubes annotés : CD1 (pour contrôle de la digestion 1), CD2 (pour contrôle de la digestion 2) et DD (pour la double digestion).
Dans le tube CD1 on mélange 2.5µL de la réaction A avec 2.5 µL de la réaction C, les mêmes volumes sont ajoutés dans le tube CD2 mais cette fois ci avec les réactions B et C. Enfin les restes de volumes des réactions A et B sont mélangés dans le tube DD. La digestion enzymatique est effectuée à 37°C pendant 2h suivi d’une migration sur gel d’agarose 1x qui permet de vérifier la digestion (Figure 45).
b) Déphosphorylation de l’extrémité 5’ et 3’ phosphate
Les vecteurs linéarisés sont ensuite traités à la phosphatase rSAP. Un volume de 1µL (stock 500 U new england biolabs) de phosphatase est ajouté à la réaction de double digestion (DD), le mélange est de nouveau incubé à 37°C pendant 1h puis l’échantillon est migré sur gel d’agarose 1x en présence de sybR GREEN. Le fragment correspondant au vecteur linéarisé est
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ensuite extrait et purifié en utilisant les colonnes Qiagen selon le protocole fournis dans le kit commercial (Qiaprep gel extraction). La quantité d’ADN obtenue est mesurée au spectrophotomètre Denovix DS-11+
Le clonage des fragments de protéines est fait la méthode SLIC.
3. Clonage SLIC (Sequence and Ligation Independent
Cloning)
Cette méthode est basée sur l’utilisation de l’activité exonucléolytique (3’→ 5’) de l’ADN polymérase T4 qui va générer des extrémités simples brins flanquants dans le vecteur d’expression et l’insert. Par complémentarité des séquences simples brins, les deux fragments linéarisés vont s’apparier et le tout sera réparer par une transformation chez la bactérie E. coli. Pour notre réaction de clonage, nous avons travaillé avec le ratio (1:3) qui correspond à une quantité de vecteur pour trois quantités d’insert.
Pour une réaction de 10µL on procède au mélange suivant : 1 µL de BSA (stock 10mg/ml), 1 µL de tampon NEB 2 (stock 10x New England Biolab), une quantité pour 100 ng de vecteur, une quantité pour 300 ng d’insert, 0.5 µL d’enzyme T4 DNA polymerase (new england biolabs stock 3000 U/ml), qsp pour 10 µL d’eau.
La réaction est ensuite incubée à température ambiante pendant 10 min puis une transformation chimiocompétente est effectuée :
4. Transformation chimiocompétente
Un volume de 5µl de la réaction de clonage est transformé dans 50 µL de bactéries compétentes
E. coli DH5α. Le mélange est incubé sur glace pendant 30 min puis un choc thermique de 45
sec à 42°C permet perméabiliser les membranes bactériennes. Le mélange est de nouveau incubé sur glace pendant 5 min puis un volume de 300 µL de milieu 2yt est ajouté. Les bactéries sont ensuite incubées à 37°C sous agitation pendant 1h et étalées sur boîte de pétri contenant les antibiotiques correspondants. Celles-ci sont enfin incubées sur la nuit à 37°C.
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5. Vérification de la présence de colonies positives
a) PCR colonie
Les colonies issues de la transformation sont vérifiées par la méthode de PCR colonie qui peut s’organiser comme suit :
En générale, on teste 4 à 5 colonies et chaque colonie est inoculée dans 50 µL de milieu 2yt puis incubée pendant 2 h à 37°C. On prépare ensuite le mélange appelé « master mix » de 50 µL contenant 0.5 µL primer 5’ (stock 100 pmol/µL), 0.5 µL primer 3’ (stock 100 pmol/µL), 1 µL dNTP (stock 10 mM), 0.25 µL Phusion polymerase New England biolab (2000 U/ml), 10 µL GC green Buffer thermofisher (stock 5x) and qsp d’eau.
Dans des tubes PCR, on ajoute 0.6 µL qui a été prélevé de chaque la culture incubée à 37°C puis 9.6 µL du mix commun. On procède ensuite à la réaction comme précédemment mais pour l’hybridation on se met à une température constante qui est de 50°C. Les fragments PCR sont ensuite analysés sur gel d’agarose 1x en présence de BET et les colonies qui présentent le fragment d’intérêt sont inoculées dans un volume de 5mL de milieu 2yt puis la culture est incubée sur la nuit à 37°C.
b) Extraction du plasmide
Les cultures sont centrifugées à 20°C pendant 10 min puis le culot est récupéré. L’ADN plasmidique contenant le gène d’intérêt est extrait à partir de la biomasse bactérienne en utilisant un kit commercial (kit miniprerp Qiagen). La concentration du plasmide d’intérêt est ensuite mesurée avec le dénovix.
c) Double digestion enzymatique
Une double digestion enzymatique NdeI/BamHI (New england biolabs) est effectuée selon le protocole suivant :
pour 10 µl on ajout 5 µL d’ADN plasmidique (150-200 ng/µL), 1 µL de tampon cutsmart 10, 0.5 µL de chaque enzyme de restriction (20000U/ml) , et 3 µL d’eau. La réaction est ensuite incubée à 37°C pendant 1h puis on rajoute 2 µL de tampon de charge (6x DNA loading dye thermofisher). L’échantillon est ensuite chargé sur gel d’agarose 1x en présence de BET. La migration se fait pendant 20 min à 230V puis les fragments sont révélés sous UV.
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Les plasmides contenant le fragment d’intérêt sont ensuite envoyés à séquencer puis garder à -20°C pour les tests d’expression.