Constructions plasmidiques et transfection de T. gondii
Le mutant conditionnel TgAGPAT-iKO a été généré selon la stratégie décrite dans Striepen and Soldati (2007) et Sheiner et al. (2011). La région 5’ de la séquence génomique de TgAGPAT correspondant à l’exon1 et l’intron1 du gène a été amplifiée en utilisant le couple d’amorces 5’-AGATCTCTCTCACGGTGGCAAGATGGCGT-3’ et 5’-CCTAGGCCGGCAACAAACAAGGAACGCAGAT-3’. Le fragment de 755 pb a été digéré par les enzymes de restriction BglII et AvrII et inséré dans le plasmide contenant le promoteur inductible (pDt7s4H3, p : plasmide, D : cassette DHFR, t : tetO, s4 : promoteur Sag4, H3 : 3-HA) linéarisé avec les mêmes enzymes. La région 5’UTR du gène TgAGPAT a été amplifiée avec le couple d’amorces
5’-CATATGGGATCGTGAAGGTTTTGCCGACAAG-3’ et
5’-CATATGGGGGCAAAGCGGAGGCTGGTCAAA-3’. Le fragment d’ADN obtenu de 1185 pb a été digéré avec l’enzyme de restriction NdeI et inséré dans le plasmide pDt7s4::TgAGPAT-H3 linéarisé avec la même enzyme au niveau de la région 5’UTR de la cassette DHFR. Les clones isolés contenant le vecteur pDt7s4::TgAGPAT-iKO sont linéarisés avec l’enzyme de restriction XcmI et 100 µg de plasmide ont été transfectés dans les tachyzoites (TATi-∆Ku80) fraichement sortis de leurs cellules hôtes (Sheiner et al. 2011). L’électroporation a été réalisée dans des cuvettes 2 mm BTX ECM 630 (Harvard Apparatus) à 1,100 V, 25 Ω, et 25 µF. Les parasites ont été sélectionnés grâce à la cassette DHFR qui leur confère la résistance à la pyriméthamine (1µM). L’intégration du promoteur dans le locus a été confirmée par PCR dans une population mixte. Ensuite, les clones résistants ont été isolés par une dilution limitée et criblés par PCR et Southern-blot.
Extraction d’ADN génomique et Southern-blot
L’intégration du promoteur inductible au locus TgAGPAT dans la lignée d’intérêt iKO a été analysée par Southern-blot. Le génome des souches TgAGPAT-iKO et RH-∆ku80 a été isolée à partir de parasites fraichement sortis (107 parasite/ml). Les parasites sont filtrés, lavés au PBS et centrifugés 10 min à 2000 g. Le culot de parasites est ensuite suspendu dans un tampon ETDA et la lyse cellulaire est réalisée à
55°C pendant 1h avec 1% SDS, 10 µg RNase et 20 µg de protéinase K. Une extraction au phénol/chloroforme est réalisée pour éliminer toute contamination. 10 µg d’ADN génomique sont par la suite digérés par les enzymes de restriction BglII ou BclI/AvrII toute la nuit à 37°C. Les fragments digérés sont séparés sur un gel d’agarose à 0.8%. Le transfert des fragments d’ADN est réalisé sur une membrane Hybond N+ (GE Healthcare) et le Southern-blot est alors réalisé en utilisant des sondes marquées DIG (kit d’amplification Roche) d’une longueur de 500 pb, spécifiques : i) à la région 5’UTR de TgAGPAT (Fig. 20a-b, sonde rouge), ii) de la cassette DHFR (Fig. 20a-b, sonde violette) et iii) de l’exon 3 de TgAGPAT (Fig. 20a-b, sonde bleu).
RT-PCR semi-quantitative
Afin de confirmer l’inhibition de l’expression de TgAGPAT-iKO par l’addition de l’anhydrotétracycline (ATc), une RT-PCR semi-quantitative a été réalisée. Les extraits ARN totaux sont obtenus à partir de trois cultures de parasites indépendantes en présence de 1 µg/ml d’ATc et en utilisant un kit d’extraction d’ARN (Machery Nagel). Les trois extraits correspondant à chacune des souches sont assemblés. Une rétro transcription est réalisée sur chacun des extraits d’ARN (100 ng) en triplicata, en utilisant des OligodT (Thermo OligodT18) et une enzyme RT transcriptase SuperScript III (Invitrogen). Les conditions utilisées pour cette amplification sont conformes aux instructions définies par le fabricant. Les amplifications par PCR sont faites avec l’enzyme Taq Ozyme HS (Ozyme) à partir des dilutions de cDNA (1 :10, 1 :100 et 1 :1000). Les conditions de PCR sont : une première dénaturation à 94⁰C pendant 2 min, 28 cycles d’amplification constitués d’une phase de dénaturation de 94°C de 30 sec, une phase d’alignement à 59°C et 60 °C de 15 sec chacune et phase d’élongation à 72°C de 1 minute et finalement d’une élongation à 72°C pendant 3 min. Pour le fragment 1 (224 pb) le couple d’amorces utilisé est : CGTTTTCTTTCTGCTGGCCTTCCT-3’ et 5’-TCGCGTGGTTGCACATGATGATG-3’, pour le fragment 2 (366 pb), les amorces
sont : 5’-CGAGGTGTTGGACTCCGGGA-3’ et
5’-TAGAGACCGTGGCCTCGGTGG-3’. Une amplification de l’actine 1 (384 pb) sur la fraction de cDNA est réalisée comme control positif de la RT-PCR en utilisant les
amorces : 5’-GCGCGACATCAAGGAGAAGC-3’ et
Résultats et discussion
Quand j’ai commencé mon étude doctorale, les données bio-informatiques sur la base de données ApiLoc (http://apiloc.biochem.unimelb.edu.au/apiloc/apiloc), suggéraient que TgAGPAT (TGME49_240860) serait plastidiale. L’analyse de la séquence en acides aminés prédisait la présence d’un signal peptide mais pas de transit peptide. Nous avons alors décidé d’insérer une étiquette HA en région C-terminal de la séquence du gène de TgAGPAT pour éviter une mis-localisation dans le réticulum endoplasmique éventuellement due au clivage du signal peptide. Cependant toutes les tentatives d’étiquetage en utilisant le plasmide pLIC-HA-DHFR ont abouties à l’absence d’un signal HA en immunofluorescence et en Western-blot. Toutefois, les parasites négatifs au signal-HA présentaient une forte résistance à la pyriméthamine. D’autres étiquettes ont été testées comme myc et Ty mais sans succès. Nous avons alors émis l’hypothèse que le marquage avec un épitope-HA en région N-terminal pouvait déstabiliser les modifications post-traductionnelles de TgAGPAT conduisant à la dégradation de la protéine. En effet, celle-ci possède un résidu Ser phosphorylé en position 275/281 acides aminés. Par ailleurs, aucun criblage par PCR n’a permis d’identifier des clones ayant intégré l’étiquette HA et la cassette de résistance au bon locus. De ce fait, nous avons émis l’hypothèse que l’enzyme est peut être essentielle pour le développement intracellulaire de T. gondii et que les parasites exprimant une protéine TgAGPAT défectueuse sont létaux. Nous avons alors décidé de générer un mutant inductible à l’anhydrotétracycline (ATc) par un remplacement du promoteur endogène par un promoteur inductible tetO (Meissner et al., 2002) comme décrit dans la Fig. 20a. J’ai alors, utilisé le plasmide pDt7s4H3 dans lequel j’ai inséré deux régions d’homologie correspondant à la région 5’UTR de TgAGPAT et à la région 5’ de la séquence génomique de TgAGPAT contenant le codon ATG, respectivement de part et d’autre de la cassette DHFR et du promoteur tetO-Sag4 (Fig. 20a). Les clones résistants à la pyriméthamine ont été isolés et confirmés par Southern-blot (Fig. 20b). Le clone TgAGPAT-iKO-2 semble avoir intégré la cassette de résistance à la DHFR en amant du gène TgAGPAT contrairement au clone TgAGPAT-iKO-1 qui semble ne pas être isolé et présente les deux profils, sauvage et muté (Fig. 20b). Afin de confirmer la répression de l’expression de TgAGPAT par un traitement à l’ATc (1µg/ml) dans le milieu de culture, une RT-PCR semi-quantitative a été réalisée en utilisant deux couples d’amorces spécifiques à la séquence codante (CDS) TgAGPAT (Fig. 20c). Cette analyse
permet de visualiser sur un gel d’agarose la réduction de la transcription du gène TgAGPAT par le traitement d’ATc qui se traduit par une diminution de la quantité relative de son ARNm dans la fraction des ARN totaux. Ainsi, j’ai pu constater que l’expression de TgAGPAT dans deux clones différents TgAGPAT-iKO n’est pas affectée par l’addition de l’ATc (Fig. 20d). En effet, en comparant le J-1 et le J-4 de chacun des mutants inductibles TgAGPAT-iKO et la souche parentale TATi-∆ku80, il n’y a pas de différence. L’amplification d’une région de la séquence codante pour l’actine 1 (ACT1) est un control positif permettant de visualiser la diminution de la quantité relative de l’amplicon en fonction à la dilution de la banque cDNA et non pas affectée avec le traitement ATc (Fig. 20d). Ces résultats suggèrent que l’expression de TgAGPAT n’est pas contrôlée par le promoteur tetO et l’ATc ne réprime pas son expression. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ce résultat dont la première serait une intégration non spécifique du promoteur inductible et de la cassette de résistance. L’analyse de la séquence nucléique de TgAGPAT et de la région 5’UTR par un BLAST dans la base de données ToxoDB, n’a pas révélé la présence d’une autre région génomique qui présente un fort taux d’homologie avec les deux séquences utilisées comme régions d’homologie. J’ai alors examiné la présence de site d’épissage alternatif, un autre codon ATG ou encore un autre promoteur que celui prédit. L’analyse par le logiciel en ligne NetPlantGene (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPGene/) n’a pas révélé la présence d’un éventuel site d’épissage alternative dans le cadre de lecture. Cependant, l’analyse de la présence d’un autre codon ATG a révélé la présence de six autres codons dans le même cadre de lecture et en amant du site catalytique. Ceci peut éventuellement suggérer la présence d’un autre promoteur en amant de l’un de ces six codons ATG. L’analyse de la séquence codante TgAGPAT en amant du site catalytique
avec le programme en ligne SoftBerry BPROM
(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom) ne suggère pas la présence d’un autre promoteur possible dans les exons 1 et 2 en amant du site catalytique. Cette analyse a été réalisée précédemment sur un gène de T. gondii qui a permis l’identification d’un promoteur procaryote fonctionnel dans l’exon 1 du gène codant pour une choline kinase (Sampels et al., 2012). Cependant, ceci n’est pas le cas de TgAGPAT. On a alors émis l’hypothèse que la modification de la séquence génomique de TgAGPAT peut être létale pour le parasite ce qui peut éventuellement témoigner de l’importance vitale de cette enzyme pour le parasite.
Figure 20 : Stratégie de génération du mutant inductible TgAGPAT-iKO. a) Schéma
représentant la stratégie de recombinaison homologue pour l’insertion d’un promoteur inductible tetOSag4 en amant de la séquence génomique TgAGPAT afin de générer un mutant inductible TgAGPAT-iKO résistant à la DHFR. b) Analyse par Southern-blot pour confirmer l’insertion du promoteur inductible par recombinaison homologue au locus cible. PM : poids moléculaires ; kb : kilo bases. Les différentes sondes utilisées sont représentées en rouge, violet et bleu et les gels correspondant à chacune des sondes sont entourés de la couleur correspondante. c) stratégie de criblage par RT-PCR semi-quantitative de l’inhibition du promoteur tetOSag4 en présence de 1 µg/ml d’ATc. 1 et 2 représentent les régions amplifiées par RT-PCR semi-quantitative. Les ARN totaux des parasites cultivés en présence d’ATc 24 h (J-1) ou quatre jours (J-4) sont extraits et rétro transcrits par un OligodT (d).* : amplification correspond aux fragments génomiques. Pb : paire de bases. TgACT1 : control positif de la RT-PCR semi-quantitative sur l’ADNc de l’actine 1.
A l’issu de cette étude, il n’a malheureusement pas été possible de caractériser le phénotype d’un mutant inductible de TgAGPAT et la compréhension de son implication dans la synthèse de lipides membranaires de T. gondii. Cependant, le mutant stable CRISPR pour TgAGPAT (voir article plus haut) ne présentait pas de défauts morphologiques en immunofluorescence. Toutefois, cette analyse a été réalisée 48 h post-transfection. Il faudra essayer de générer des mutants stables et les isolés immédiatement après la transfection pour l’obtention de clones indépendants. En effet, au laboratoire, on ne dispose pas d’un anticorps anti-AGPAT et l’incapacité d’étiqueter la protéine peuvent être des facteurs limitants pour sélectionnes des mutants isolés à partir d’une population mixte surtout s’ils présentent un défaut de croissance quelconque. Par ailleurs, il serait aussi intéressant de refaire une tentative d’étiquetage de la protéine en région C-terminal ou N-terminal, maintenant que l’enzymes a été localisée dans le réticulum endoplasmique, peut être en utilisant le système CRISPR-Cas9 (Sidik et al., 2014). Cette étude permettra de compléter notre compréhension sur la collaboration entre la voie procaryote de synthèse des précurseurs lipidiques dans l’apicoplaste et son homologue eucaryote dans le réticulum endoplasmique.