Généralités sur la molécule d’ADN

II.1.1. Structures de l’ADN

La structure de l’ADN a été élucidée pour la première fois en 1953 par James Watson et Francis Crick.52 Ils ont montré que la macromolécule biologique, ADN, est formée par deux chaînes de polymères complémentaires qui s’emboitent tout en s’enroulant l’une autour de l’autre pour former une double hélice.

• Structure primaire

La structure primaire de la molécule d’ADN est une séquence linéaire de nucléotides. Chaque nucléotide est formé d’une base azotée liée à un sucre à cinq carbones (désoxyribose) qui possède un groupement phosphate fixé à son carbone 5’ (voir figure I.9). L’ADN contient quatre types de bases azotées liées au carbone 1’ du sucre: deux bases puriques, l’adénine (A) et la guanine (G), et deux pyrimidiques à savoir la cytosine (C) et la thymine (T) (Figure I.8).

Le brin d’ADN possède une orientation chimique due à la position des phosphates sur les sucres en 3’ ou en 5’. L’extrémité 5’ présente un groupement hydroxyle ou phosphate sur le carbone 5’ de son dernier sucre. L’extrémité 3’ quant à elle possède habituellement un groupement hydroxyle au niveau du carbone 3’ de son dernier sucre (figure I.9). Cette orientation, ajoutée au déroulement de la synthèse dans le sens 5’ vers 3’, fait que par convention les séquences polynucléotidiques sont écrites et sont lues dans le sens 5’
_{3’. Les liaisons phosphodiester relient le phosphate à deux carbones} inéquivalents, C3’ et C5’ et des désoxyriboses voisins (Figure I.9). Les groupements phosphates sont

chargés négativement dans les conditions physiologiques.

Figure I.8. Les quatre bases A, G, C et T de l’ADN. Dans les nucléotides, elles sont attachées à un sucre (désoxyribose) indiqué par R.

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Figure I.9. Structure du squelette d’un simple brin d’ADN. La structure chimique montre un groupement hydroxyle au niveau de l’extrémité 3’ et un groupement phosphate au niveau de l’extrémité 5’. Deux liaisons phosphodiester relient les deux nucléotides adjacents. Par convention, une séquence d’ADN est toujours écrite dans le sens 5’
3’.

• Structure secondaire

La molécule d’ADN est constituée de deux brins polynucléotidiques associés, qui s’enroulent l’un autour de l’autre pour former une double hélice. La double hélice est maintenue grâce aux liaisons hydrogènes qui se forment entre les bases de chaque brin. L’orientation des deux brins est dite

antiparallèle, c'est-à-dire que les directions 5’
3’ sont opposées dans le double brin (Figure I.10a).

L’appariement spécifique des bases deux à deux entraîne la complémentarité des deux brins. A s’apparie avec T par deux liaisons hydrogène et G avec C par trois liaisons hydrogène (figure I.10b). Ces associations entre une purine et une pyrimidine sont appelées paires de bases de Watson-Crick.52 La présence de ces liaisons hydrogènes dans une double hélice d’ADN contribue fortement à sa stabilité. H H 3’ 5’ H H 1’ 2’ H 3’ 4’ 5’ H 3’ 5’ Liaison phosphodiester Extrémité 3’ Extrémité 5’

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Figure I.10. La double hélice d’ADN. (a) un modèle compact de l’ADN B, forme la plus courante d’ADN dans les cellules. Les flèches en blanc indiquent le sens 5’
3’ de chaque brin. Les liaisons hydrogènes entre les bases sont au centre de la structure; (b) Structure chimique de la double hélice d’ADN montrant les liaisons hydrogènes entre les paires de bases de type Watson-Crick A=T et G≡C.53

Le simple brin d’ADN peut être noté ADNS ou ADNAS. L’ADNS correspond au brin sens et celui noté

ADNAS correspond au brin antisens. En effet le brin sens est celui qui a la même séquence

nucléotidique que l’ARN messager. Le brin antisens, quant à lui sert de matrice à la polymérase. L’ARN étant polymérisé du 5’
_{3’, la matrice (brin antisens) peut donc être représentée du 3’
5’.} Le brin complémentaire (brin sens) est donc représenté du 5’
3’. Ce qui revient à représenter dans le

cas d’un oligonucléotide ADN double brin de 22 bases de séquence quelconque de la façon suivante:

ODNS 5’

CCT CGC TCT GCT AAT CCT GTT A3’-C6H12-OH

ODNAS OH-H12C6- 3’

GGA GCG AGA CGA TTA GGA CAA T5’

La double hélice de la molécule d’ADN a un pas (correspondant à un tour d’hélice) de 3.6 nm et un diamètre de 2 nm.54 La distance entre deux paires de bases est de 3.4 Å, ce qui donne 10 paires de bases par pas d’hélice. L’une des particularités de la double hélice d’ADN est qu’elle présente un petit et un grand sillon: le petit sillon correspond au plus petit écart formé entre les deux brins, et le grand sillon au plus grand écart (figure I.10 a). Il s’agit d’une hélice droite et correspond à la forme B de l’ADN, qui est la forme normalement présente dans la plupart des segments d’ADN cellulaires. En

(a) (b)

5’

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plus de la forme B prédominante, deux autres structures d’ADN sont décrites. Il s’agit de l’ADN A et l’ADN Z.

• Structures tertiaire et quaternaire

L’ADN peut former un autre type d’appariement que celui de Watson et Crick entre les bases AT et GC. Une troisième base peut se rajouter, on parle alors d’appariement de Hoogsteen.55 La double hélice peut accueillir ainsi une troisième chaîne polynucléotidique. La structure formée est un triplex d’ADN.

La molécule d’ADN peut également former des quadruplex. Elle peut également se replier sur elle- même en formant des structures en épingle à cheveux. La formation de cette structure est très dépendante des paires de bases.

II.1.2. Dénaturation de l’ADN

La séparation des deux brins d’ADN, que l’on appelle dénaturation ou «fusion», peut être provoquée expérimentalement en élevant la température dans une solution d’ADN. L’accroissement de l’agitation moléculaire finit par rompre les liaisons hydrogène et les autres forces stabilisant la double hélice. Les brins se séparent alors et s’éloignent l’un de l’autre en raison de la répulsion électrostatique entre groupements phosphates. Cette réaction de fusion de l’ADN peut être suivie en mesurant l’absorbance d’une solution d’ADN. La longueur d’onde utilisée est en général de 260 nm. En effet l’ADN simple brin et la double hélice n’ont pas la même absorption, la dénaturation s’accompagne d’un effet hyperchromique, se matérialisant par une augmentation de l’absorbance (Figure I.11). La température de fusion, Tm à laquelle les brins d’ADN se séparent, dépend de plusieurs facteurs, dont en premier

lieu la proportion de paires de bases GC. En effet, une forte proportion de paires GC entraine une Tm

élevée car les trois liaisons hydrogène dans les paires GC rendent ces paires de bases plus stables que les paires AT. La concentration ionique influence également la Tm car les groupements phosphates

chargés négativement dans les deux brins sont écrantés par les ions positifs. Par conséquent une haute force ionique augmente la Tm de par la stabilisation de la double hélice d’ADN par les cations positifs.

Figure I.11. Courbe d’hybridation de l’ADN. Tm correspond à la température à laquelle 50% de brins

sont sous la forme simple brin.

ADN simple brin

ADN double brin

Tm Température (°C)

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