Chapitre 3 Les activités biologiques
III.2. Généralités sur le diabète
L’OMS le définit par une glycémie supérieure à 1,26 g/L (7mmol/L) après un jeûne de8 heures vérifiée par deux prises de sang consécutives, ou supérieur à 2g/L quelque soit l’heure du prélèvement en présence de symptômes clinique polyurie, polydipsie et amaigrissement (Scheen et Luyckx, 2010), c’est une pathologie du métabolisme en glucose provoquée par un dysfonctionnement des cellules β des ilots de Langerhans, sécrétrices de l’insuline, ou une mauvaise assimilation de cette dernière par les tissus périphériques (l’insulinorésistance) (Wens et al., 2005).
Chapitre 3 Aperçu sur l’inflammation et le diabète
35 III.2.2. Classification du diabète :
Selon l’étiologie et la physiologie, quatre grands groupes de diabète sont distingués selon la dernière révision de la classification du diabète (Guillausseau, 1997). Diabète type I(DTI), Diabète type II (DTII), Diabète gestationnel (DTG) et Autres types spécifique de diabète.
a) Le diabète de type I :
Le diabète type I, également appelé diabète insulinodépendant ou autrefois, diabète juvénile, est un état d’hyperglycémie chronique dû à une affection de pancréas endocrine dont les îlots de Langerhans ne secrète plus d’insuline (insulinopénie) (Calop et al., 2008). C’est une forme de diabète sucré qui apparait de manière brutale chez l’enfant et l’adolescent, mais peut également survenir chez le jeune adulte (<40ans) et il concerne 10% des diabétiques.
On distingue deux sous-types dans la classification de l’American Diabètes Association (Senee, 2006), le diabète de type I’ auto-immun au cours duquel la destruction des cellules β par un processus auto-immun est authentifiée par la présence d’anticorps anti-cellules d’îlots.
Cette forme est la plus fréquente elle représente plus de 90 % des cas en Europe. Le diabète de type I idiopathique caractérisé par l’absence d’auto-anticorps, il s’agit d’un cadre nosologique mal défini, incluant les diabètes cétosiques du sujet noir originaire d’Afrique subsaharienne et les diabètes suraigus japonais.
b) Le diabète de type II :
Autrefois dit non insulinodépendant ou diabète d’âge mûr, il survient généralement chez les sujets d’âge mûr (plus de 40 ans). C’est la forme la plus répandue (90% des cas) dans toutes les régions de globe (Portha, 2003).
L’hyperglycémie dans le diabète de type II est due à une réduction du captage du glucose et à une production glucosée hépatique excessive, liées à une diminution de l’insulinosécrétion et de l’insulinosensibilité (Virally et al., 2007).
Chapitre 3 Aperçu sur l’inflammation et le diabète
36
L’insulinorésistance ou anomalie de l’action de l’insuline en périphérie, est la deuxième anomalie observée. Elle se traduit au niveau hépatique par une augmentation de la production de glucose et au niveau musculaire, par une diminution de l’utilisation du glucose, (Busch-Brafin et Pinget, 2001 ; Scheen et Luyckx, 2010), le diabète type II a un caractère familial et est souvent associe à un excès de poids (obésité), à l’hypertension artérielle et à l’hypertriglycéridémie (Grimaldi, 2004).
Partie II
Étude expérimentale
Chapitre I
Matériel et méthodes
Chapitre 1 Matériel et méthodes
37 I. Matériel et méthodes :
I.1.Matériel végétal
:
Nos travaux de recherche ont été réalisés au sein du laboratoire de Biochimie Appliquée, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Université des frères Mentouri, Constantine. Le choix de la plante s’est porté sur l’espèce Myrtus communisL. , appartenant à la famille des Myrtaceae.
Pour la mise en évidence de métabolites secondaires tels que les composés phénoliques, terpènes et alcaloïdes dans trois organes différents de la plantes qui sont : tiges, feuilles et fruits.
L’élucidation de ces groupes chimiques cités est basé sur une étude et un screening phytochimique et des phénomènes de coloration et de précipitation.
I.1.1.
La récolte de la matière végétale :La plante Myrtus communis L. A été récoltée le mois d’octobre 2018 à Chakfa, wilaya de Jijel (Nord-est Algérien). Les parties aériennes de la plante cueillit ont été conservées à une température de 4C° , jusqu’à l’extraction des métabolites secondaires .Les paramètres géographiques de cette région sont représentés dans le tableau (4).
Tableau 04 : Paramètres géographiques de la région Chakfa wilaya de Jijel.
Station Altitude Latitude Longitude L’étage bioclimatique
Chakfa 25 km à l’est de Jijel 36.7713 5.95953 Humide à hiver chaud
I.1. 2.
Broyage des parties sèches :Les différents organes du matériel végétal sélectionnés du myrte (feuilles, tiges, fruits) ont été séchés dans une température ambiante et à l’abri de la lumière pendant quelques jours.
Une fois séchées les trois parties de la plante sont broyées à l’aide d’un broyeur jusqu’à obtention d’une poudre fine, prête à la préparation des extraits.
Chapitre 1 Matériel et méthodes
38
Une étude phytochimique d’une espèce végétale passe par ces étapes suivantes :
La récolte de la plante
Séchage
Broyage
Extraction
Séparation et identification des métabolites isolés.
a) Poudres des feuilles b) Broyat des fruits c) Morceaux de rameaux Figure20 : Séchage des feuilles, tiges et fruits de myrte.
I.1.3. Extraction des métabolites secondaires :
L’objectif de cette étape est d’extraire le maximum de molécules chimiques contenues dans les parties aériennes de la plante pour étudier leur pouvoir pharmacologiques.
La macération est une méthode d’extraction solide-liquide très simple s’obtient en mettant la plante en contact au froid avec un solvant quelquonque.
a) Préparation de l’éxtrait hydro méthanolique :
Protocole :
L’identité de cette plante Myrtus communis L. A été confirmée par le laboratoire de botanique de l’université des frères Mentouri.
La matière végétale (feuilles, tiges, fruits) a été mise à macérer dans le systhéme solvant suivant : 100 ml hydro- méthanolique 70% méthanol, Après une macération de 72 heures à température ambiante, le mélange est filtré, 100g de la plante broyée sous forme de poudre et
Chapitre 1 Matériel et méthodes
39
morceaux ont été pesées avec une balance de la marque (KERN), puis ont été mélangés dans un erlen mayer avec 300 ml du solvant hydro- méthanolique.
Figure21: Macérat hydro-méthanolique des feuilles fruits et tiges.
Le mélange a été ensuite filtré avec du coton, le surnageant obtenu est filtré sous vide à l’aide d’un Büchner sur un papier filtre et on obtient le filtrat.
Figure 22: La filtration du macérât des feuilles.
Chapitre 1 Matériel et méthodes
40
Cette étape est utilisée pour éliminer la chlorophylle pendant la préparation de l’éxtrait méthanolique
,
l’opération est répétée trois fois avec renouvellement de système solvant toute les 24 heures. Les extraits filtrés sont regroupés et évaporés à l’aide d’un rota-vapeur dans une température de 40°C.Chapitre 1 Matériel et méthodes
Chapitre 1 Matériel et méthodes
42 La partie expérimentale :
I.2.
Tests phytochimiques :Les tests phytochimiques sont des techniques qui permettent de déterminer les différents groupes chimiques contenus dans un organe végétal par des réactifs chimiques spécifiques.
I.2.1. Détection des Polyphénols :
I.2.1.
Détection des Quinones libres :0.5 g de matériel végétal sec et broyé et placé dans des tubes avec 20 à 30 ml d’éther de pétrole Après agitation et un repos de 24heures, après les extraits sont filtrés.
La présence de quinones libres est confirmée par l’ajout de quelques gouttes de NaOH (10%), lorsque la phase aqueuse vire au jaune, rouge ou violet (Ribérreau, 1968).
I.2.1.2.
Criblage des Anthraquinones:
À l’extrait chloroformique de chacun des organes, on ajoute du KOH aqueux 10 % (v/v).
Après agitation, la présence des anthraquinones est confirmée par un virage de la phase aqueuse au rouge. (Ribérreau, 1968).
I.2.1.3.
Criblage de Flavonoïdes :Se réalise à partir de 30 mg d’extrait hydrométhanolique reparti dans 3 tubes, le 1er servant de témoin, les 2 autres pour les deux tests (test de Wil stater et test de Bate-Smith) : Test de Wilstater : HCl concentré en présence de trois ou quatre tournures de magnésium. Le changement de coloration est observé (Karumi, 2004).
Test de Bate-smith : Additionner dans le 3émé tube HCl concentré (0,5ml) et porter au bain marie pendant trente minutes. L’apparition d’une coloration rouge dénoté la présence de leuco anthocyanes.
Chapitre 1 Matériel et méthodes
43
I.2.1.4
. Criblage des Tanins :100mg d’extrait hydrométhanolique sont dissout dans 25ml d’eau distillée chaude puis additionner de trois à quatre de NaCl10, la solution ainsi obtenue est filtrée, le filtrat est ensuite réparti dans quatre tubes à essai, le 4éme tube servant de témoin :
Tube n°1 : addition de quatre à cinq gouttes de gélatine à 1%.
Tube n°2 : addition de quatre à cinq gouttes de gélatine salée (gélatine 1% + NaCl 10%) L’apparition d’une précipitation par la gélatine salée signifie la présence de Tanins.
Tube n°3 : addition de quatre à cinq goutes de FeCl31%.
La couleur vire au bleu noirs en présence de tanins galliques et au brun verdâtre en présence de tanins catéchique (Rizk, 1982).
I.2.2.
Détection des Stérols, Stéroïdes et Tritérpénes : Protocole expérimentale :
Dépigmenter 100mg d'extrait hydro alcoolique par addition de 10ml de cyclohexane et agitation pendant 5minutes. Dissoudre le résidu dépigmenté dans 10ml de chloroforme.
Sécher la solution obtenue sur Na2SO4anhydre, puis filtrer. Répartir le filtrat dans quatre tubes à essai, le 4ème tube servira de témoin.
Tube n°1: test de Salkowski: incliner le tube à 45°, ajouter 1 à 2ml de H2SO4, Le changement de coloration est noté immédiatement. Agiter le mélange légèrement et noter le changement graduel de coloration : une coloration rouge indique la présence de stérols insaturés.
Tube n°2: test de Libermann-Burschard : additionner trois gouttes d'anhydride acétique puis agiter légèrement. Ajouter une goutte de H2SO4 concentré. Le changement de coloration est observé pendant une heure, une coloration bleu-vert indique la présence de stéroïdes tandis que rouge-violet à rose dénote la présence de triterpènes.
Tube n°3: Testde Badjet-Kedde: Additionner quelques grains d'acide picrique.
L'apparition d'une coloration orange est due aux stéroïdes lactoniques.
Chapitre 1 Matériel et méthodes
44
Tube 4 : Test de Badjet-Kedde: Addition de quelques grains d’acide picrique l’apparition d’une coloration orange montre des stéroïdes laconiques.
I.2.3.
Détection des saponosides :Pour l’identification rapide d’un organe a saponosides, il suffit de mettre en évidence leur pouvoir aphrogéne en observant la mousse très fine qui se forme après une simple agitation énergique (pendant 15 secondes) de cette poudre en présence d’eau distillé et sa persistance au moins 10 min., 1 g de poudre végétal est introduit dans des tubes avec 10 ml d’eau distillée puis on chauffe le mélange au bain marie à 85°C Pendant 20 min, après on agite vigoureusement chaque tube, en position horizontale pendant 15 secondes environ portoir, après 10 min au repos on compare les hauteurs des mousses.
- Pas de mousse : test négatif.
- Mousse moins de 1cm : test faiblement positif.
- Mousse de 1 à 2cm : test positif.
- Mousse plus de 2cm : test très positif.
I.
2.4.
Evaluation de l'activité anti-inflammatoire : a. Matériel végétal :Le matériel végétal est constitué de2 extraits hydro-méthanoliques, feuilles et fruits de Myrtus communis L.
b.Matériel animal :
Des rats adultes males de souches Wistar dont le poids est compris entre 357 et 210 g ont été utilisés pour cette étude. Ces rats ont été élevés à l'animalerie de l’université des frères Mentouri.
Les rats ont été placés dans des cages étiquetées transparentes en polypropylène ou chaque cage regroupait 4 lots homogènes de 4 une semaine avant l’étude pour leur permettre une adaptation aux nouvelles conditions du milieu. (Epa et al., 2015), et vivait a une température ambiante de 20 à 24°C, avec un cycle de 10/14 h (lumière/obscurité), et disposais d’un libre accès à la nourriture et à l'eau de robinet, La litière utilisée est de la sciure renouvelée 3 fois par semaine pour garder le bon conditionnement hygiénique des rats.
Chapitre 1 Matériel et méthodes
45
Figure 24 : Rats adultes de souche wistar.
c. Réactifs :
Solution de formol 1% dans l’eau physiologique, extraits EMPL feuilles et EMMR, acide 2-[2-(2,6-dichlorophenyl)amnophényl] éthanoïque (diclofenac) comme anti-inflammatoire de référence.
Protocole expérimentale :
L'œdème est provoqué par l'injection dans l'aponévrose de la plante du pied d’une solution de formol à 1% [1]. Selon laquelle l’inflammation est induite par injection de formol au niveau de la voûte plantaire de la patte droite du rat. L’œdème causé par cet agent phlogogène sera traduit en volume et mesuré par le Pléthysmomètre ce qui permet de suivre l’évolution du processus inflammatoire. Pour chaque essai de l’activité anti-inflammatoire, trois lots de trois souris ont été utilisés. Ces souris ont été mises à jeun, 17 heures avant l’essai (Epa et al., 2015) Lot témoin : Les rats de ce lot reçoivent 4 ml/kg de la solution véhicule (eau physiologique) par voie intra-péritonéale (ip), 30 mn avant l’injection de 0.04 ml de formaldéhyde 1% dans la voûte plantaire de la patte droite du rat.
Chapitre 1 Matériel et méthodes
46
Figure 25: Injection des rats par voie intra-péritonéale.
Lot référence : Les rats de ce lot ont été traités par voie (ip) avec un anti-inflammatoire utilisé en thérapeutique, 30 mn avant l’injection du formol, l’administration de l’anti-inflammatoire se fait à raison de 25mg/kg.
Lot essai : L’extrait à tester est administré aux souris par voie (ip) à raison de 200 mg/kg ; 30 mn avant l’injection du formol.
Le suivi de l’évolution de l’œdème se fait par mesure des deux pattes : une patte traitée P(t) et une patte non traitée P(nt), et ceci à 0. 30, 60, 120, 180 mn après injection du formol.
L’activité anti-inflammatoire des produits testés et son évolution ont été estimés par la détermination des pourcentages moyens d’inhibition de l’œdème, calculés suivant la formule.
% d'inhibition = 100 x (Vt-V0) témoin - (Vt-V0) traité/ (Vt-V0) témoin - V0 représente le volume de la patte à t=0 (avant injection du formol), - Vt représente le volume de la patte à un temps (t) quelconque.
I.
2.5.
Evaluation de l’activité antidiabétique :I.2.5.1.Test de tolérance au glucose (OGTT = oral glucose tolérance test) :
Test de tolérance au glucose par voie orale est l’index dérivés L’OGTT (ou Hyperglycémie Provoquée par voie Orale, HGPO) est un test simple, utilisé en routine clinique.
Après une nuit de jeûne, des échantillons de sang, pour détermination des concentrations de glucose et de l’insuline, sont prélevés à 0, 30, 60 et 120 minutes après une charge orale de glucose (75 g) chez l’humain). La tolérance au glucose est reflétée par l’efficacité de l’organisme à faire diminuer la glycémie après une charge en glucose. (Choukem et Gautier, 2008) .
Chapitre 1 Matériel et méthodes
47 a. Matériel végétal :
Extraits hydrométhanoliques de feuilles et fruits de myrte commun, préalablement préparés par macération.
b. Matériel animal :
Des rats adultes males de souches Wistar dont le poids est compris entre 253 et 200 g, ont été utilisés pour cette étude, ces rats ont été élevés à l'animalerie de l’université des frères Mentouri.
Les rats ont été placés dans des cages transparentes en polypropylène ou chaque cage regroupait 4 lots homogènes de 4 individus chacun, et vivait a une température ambiante de 20 à 24°C, avec un cycle de 10/14 h (lumière/obscurité), et disposés d’un libre accès à la nourriture et à l'eau de robinet, La litière utilisée est de la sciure de bois, renouvelée 3 fois par semaine pour garder, le bon conditionnement hygiénique des souris.
c. Réactifs :
Solution de glucose 2g/1000g dans du sérum physiologique, extraits méthanoliques des EMMC feuilles et EMMC fruits de myrte : 200mg/kg
Du bionorm comme antidiabétique oral de référence a raison de 0.5mg/1000g
L’eau physiologique 250mg/kg comme substance témoins.
I.2.5.2. Induction du glucose :
Pour évaluer l’activité antidiabétique de l’extrait de Myrtus communisL., un diabète sucré similaire au diabète de type II a été induit par gavage d’une dose unique de glucose à raison de 2g/1000g de poids corporel aux rats mis à jeun pendant environ 16 heures.
Figure 26
:
Gavage d’une dose unique de glucose à raison de 2g/1000g de poids corporel.Chapitre 1 Matériel et méthodes
48
Protocole expérimentale :
Avant le test, les souris ont été mises à jeun pendant 16 heures.
Dans ce model expérimental, 4 lots homogènes de 4 rats male Swiss Albinos par gavage au glucose .
- Le groupe 1 (control normal) reçoit un gavage avec de l’eau physiologique NaCl 0.9 % à raison de 250mg/kg, avant 30 min de l’administration de glucose.
- Le groupe 2 (control diabétique) reçoit un gavage de bionorm à raison de 0.5mg/kg avant 30 min de l’administration de glucose.
- Les groupes 3 et 4 reçoivent respectivement un gavage unique des deux extraits EMMC feuilles et fruits de Myrtus communis L. à raison de 200mg/kg.
- L’eau physiologique, le bionorm et extraits feuilles et fruits ont étaient administré aux 4 groupes de rats à t-30min .
Les souris ont ensuite reçu le glucose de 2g/kg de poids corporel d'une solution de glucose à 100 mg / ml administré par gavage lui aussi a t0 soit âpres le prétraitement en eau physiologique, bionorm et extrait EMMC feuilles et fruits respectivement.
Le glucose sanguin a été mesuré a t :-30min, t : 0, 30min, 60min, 120min, 180min.
L’évaluation du taux glucose sanguin est faite à l’aide d’un glucomètre et des bandelettes adaptées (accu-chek active, Roche) le sang est prélevé au niveau de la veine principale de la queue (obtenu par une coupe de 2mm).
Chapitre II
Résultats et discussion
Chapitre 2 Résultats et discussion
49 II. Résultats et discussion
II.1. Screening phytochimique :
Les tests phytochimiques réalisés sur différents organes de l’espèce étudiée Myrtus communis L., afin de caractériser les groupes de métabolites secondaires. Ces réactions sont basées sur des phénomènes de précipitation ou de coloration par des réactifs spécifiques.
II.1.1. Criblage des composés phénoliques:
a. Criblage des Quinones :
Le criblage phytochimique, par le réactif spécifique NaOH a montré que les tiges et fruits de l’espèce étudiée Myrtus communis L. sont moyennement riches en quinones.
b. Criblage des Anthraquinones :
Le réactif KOH utilisé pour la détection des anthraquinones dans les extraits chloroformiques des organes étudiés (tiges, feuilles et fruits) ne contiennent pas des anthraquinones .
c. Criblage des flavonoïdes :
La mise en évidence des flavonoïdes dans les extraits méthanoliques de l’espèce Myrtus communis L. est confirmée par l’apparition d’une couleur rouge intense dans tous les organes étudiés ce qui indiquent l’abondance de cette plante en ces métabolites secondaires, ce qui est similaire, avec les travaux rapportés par Baytop et al, ( 1999) et qui ont montré également que les feuilles de myrte commun contiennent des tanins et des flavonoïdes, Figure 27 .
a. Feuilles b. tiges c. fruits Figure 27: Photographies des tests des flavonoïdes.
Chapitre 2 Résultats et discussion
50 d. Criblage des Anthocyanes :
Le criblage phytochimique des anthocyanes a révélé une forte concentration de ces molécules dans les feuilles et fruits de l’espèce Myrtus communis L. les mêmes tests ont révélé la présence d’une faible concentration en anthocyanes dans les tiges de cette plante.
Tableau 05 : Résultats du criblage des composés phénoliques de Myrtus communis L.
L’espèce . Myrtus communisL.
Organes tiges feuilles fruits
Quinones libres ++ _ ++
Anthraquinones
Flavonoïdes +++ +++ +++
Anthocyanes +++ +++ +++
Tanins condensés +++ +++ +++
- : Réaction négative
+ : Réaction faiblement positive ++ : Réaction moyennement positive
+++ : Réaction fortement positive e. Criblage des tanins :
L’apparition d’une couleur bleu noirâtre intense dans les extraits hydro-méthanoïques des feuilles, tiges et fruits du myrte avec le FeCl3indique que les feuilles, tiges et fruits de la plante Myrtus communis L. sont riches en tanins galliques.
Chapitre 2 Résultats et discussion
51
a. Feuilles b. tiges c. fruits Figure 28 : Photographies de mise en évidence des tanins.
f. Criblage des stérols stéroïdes et triterpènes :
Nos travaux de criblage, ont montré que le Myrte commun, est très riche en stérols insaturés et stéroïdes, surtout les fruits. Les stérols et triterpènes sont fortements présents dans les tiges et fruits et moyennement positif dans l’extrait méthanolique des feuilles, De même pour les stéroïdes lactoniques, qui sont moyennement abondants dans les trois organes de la plante.
Tableau(6).
Tableau 06 : Résultats de criblage des stérols, stéroïdes et triterpènes de myrte.
Organes Molécules
Feuilles Tiges Fruits
Stérols insaturé +++ +++ +++
Stéroïdes et triterpenes
+++ ++ +++
Stéroïdes lactoniques
++ ++ ++
Chapitre 2 Résultats et discussion
52
Figure 29 : Photographies des criblages des stérols, stéroïdes et triterpenes du myrte.
II.2. Activité anti-inflammatoire :
II.2.1. Criblage de l’activité antioedémateuse :
L’étude a été conçue in vivo pour évaluer l'activité anti-inflammatoire des extraits des feuilles et fruits de la plante M. communis, à la dose de 20 mg/kg en administration par voie intra-péritonéale. Les expériences sont réalisées sur le modèle de l'œdème de la patte des rats induit par le formol 1%, les résultats obtenus ont été comparés à ceux d’un médicament le diclofenac qui est un anti-inflammatoire non stéroïdien et à ceux du contrôle négatif (eau physiologique).
Après l’injection de l'eau physiologique, le formol entraîne une augmentation significative du volume de la patte des rats de 0, 33±0,005, 0,45±0,01, 0,42 ±0,01 et 0,42
±0,02 à 30 mn, 60 mn et 120 mn et 180mn. Respectivement.
L’injection du diclofenac à la dose de 10 mg/kg par voie i-p prévient de façon significative l'augmentation du volume de la patte du rat. Elle est de 0,2±0,02, 0,2±0,01, 0,2±0,005 et 0,27±0,005 de 30, 60, 120, 180 mn.
En ce qui concerne l’extrait EMMC feuilles a fortement inhibé l’évolution du volume de l’œdème de la patte du rat, de ce fait cet extrait a montré une efficacité anti-inflammatoire plus meilleur que celle du médicament, le diclofenac. Les valeurs d’inhibitions enregistrées
Chapitre 2 Résultats et discussion
53
sont de 0,1±0,011, 0,015±0,010, 0,05±0,01 et 0,15±0,01 pendant le temps .30, 60, 120 et 180 mn. Après 30 mn de l'injection du formol.
sont de 0,1±0,011, 0,015±0,010, 0,05±0,01 et 0,15±0,01 pendant le temps .30, 60, 120 et 180 mn. Après 30 mn de l'injection du formol.