Extraction des métabolites secondaires

Chapitre 3 Les activités biologiques

I. Matériel et méthodes

I.1.3. Extraction des métabolites secondaires

L’objectif de cette étape est d’extraire le maximum de molécules chimiques contenues dans les parties aériennes de la plante pour étudier leur pouvoir pharmacologiques.

La macération est une méthode d’extraction solide-liquide très simple s’obtient en mettant la plante en contact au froid avec un solvant quelquonque.

a) Préparation de l’éxtrait hydro méthanolique :

 Protocole :

L’identité de cette plante Myrtus communis L. A été confirmée par le laboratoire de botanique de l’université des frères Mentouri.

La matière végétale (feuilles, tiges, fruits) a été mise à macérer dans le systhéme solvant suivant : 100 ml hydro- méthanolique 70% méthanol, Après une macération de 72 heures à température ambiante, le mélange est filtré, 100g de la plante broyée sous forme de poudre et

Chapitre 1 Matériel et méthodes

morceaux ont été pesées avec une balance de la marque (KERN), puis ont été mélangés dans un erlen mayer avec 300 ml du solvant hydro- méthanolique.

Figure21: Macérat hydro-méthanolique des feuilles fruits et tiges.

Le mélange a été ensuite filtré avec du coton, le surnageant obtenu est filtré sous vide à l’aide d’un Büchner sur un papier filtre et on obtient le filtrat.

Figure 22: La filtration du macérât des feuilles.

Chapitre 1 Matériel et méthodes

Cette étape est utilisée pour éliminer la chlorophylle pendant la préparation de l’éxtrait méthanolique

,

l’opération est répétée trois fois avec renouvellement de système solvant toute les 24 heures. Les extraits filtrés sont regroupés et évaporés à l’aide d’un rota-vapeur dans une température de 40°C.

Chapitre 1 Matériel et méthodes

42 La partie expérimentale :

I.2.

Tests phytochimiques :

Les tests phytochimiques sont des techniques qui permettent de déterminer les différents groupes chimiques contenus dans un organe végétal par des réactifs chimiques spécifiques.

I.2.1. Détection des Polyphénols :

I.2.1.

Détection des Quinones libres :

0.5 g de matériel végétal sec et broyé et placé dans des tubes avec 20 à 30 ml d’éther de pétrole Après agitation et un repos de 24heures, après les extraits sont filtrés.

La présence de quinones libres est confirmée par l’ajout de quelques gouttes de NaOH (10%), lorsque la phase aqueuse vire au jaune, rouge ou violet (Ribérreau, 1968).

I.2.1.2.

Criblage des Anthraquinones

:

À l’extrait chloroformique de chacun des organes, on ajoute du KOH aqueux 10 % (v/v).

Après agitation, la présence des anthraquinones est confirmée par un virage de la phase aqueuse au rouge. (Ribérreau, 1968).

I.2.1.3.

Criblage de Flavonoïdes :

Se réalise à partir de 30 mg d’extrait hydrométhanolique reparti dans 3 tubes, le 1^er servant de témoin, les 2 autres pour les deux tests (test de Wil stater et test de Bate-Smith) : Test de Wilstater : HCl concentré en présence de trois ou quatre tournures de magnésium. Le changement de coloration est observé (Karumi, 2004).

Test de Bate-smith : Additionner dans le 3émé tube HCl concentré (0,5ml) et porter au bain marie pendant trente minutes. L’apparition d’une coloration rouge dénoté la présence de leuco anthocyanes.

Chapitre 1 Matériel et méthodes

I.2.1.4

. Criblage des Tanins :

100mg d’extrait hydrométhanolique sont dissout dans 25ml d’eau distillée chaude puis additionner de trois à quatre de NaCl10, la solution ainsi obtenue est filtrée, le filtrat est ensuite réparti dans quatre tubes à essai, le 4éme tube servant de témoin :

Tube n°1 : addition de quatre à cinq gouttes de gélatine à 1%.

Tube n°2 : addition de quatre à cinq gouttes de gélatine salée (gélatine 1% + NaCl 10%) L’apparition d’une précipitation par la gélatine salée signifie la présence de Tanins.

Tube n°3 : addition de quatre à cinq goutes de FeCl31%.

La couleur vire au bleu noirs en présence de tanins galliques et au brun verdâtre en présence de tanins catéchique (Rizk, 1982).

I.2.2.

Détection des Stérols, Stéroïdes et Tritérpénes :

 Protocole expérimentale :

Dépigmenter 100mg d'extrait hydro alcoolique par addition de 10ml de cyclohexane et agitation pendant 5minutes. Dissoudre le résidu dépigmenté dans 10ml de chloroforme.

Sécher la solution obtenue sur Na2SO4anhydre, puis filtrer. Répartir le filtrat dans quatre tubes à essai, le 4ème tube servira de témoin.

 Tube n°1: test de Salkowski: incliner le tube à 45°, ajouter 1 à 2ml de H2SO4, Le changement de coloration est noté immédiatement. Agiter le mélange légèrement et noter le changement graduel de coloration : une coloration rouge indique la présence de stérols insaturés.

 Tube n°2: test de Libermann-Burschard : additionner trois gouttes d'anhydride acétique puis agiter légèrement. Ajouter une goutte de H2SO4 concentré. Le changement de coloration est observé pendant une heure, une coloration bleu-vert indique la présence de stéroïdes tandis que rouge-violet à rose dénote la présence de triterpènes.

 Tube n°3: Testde Badjet-Kedde: Additionner quelques grains d'acide picrique.

L'apparition d'une coloration orange est due aux stéroïdes lactoniques.

Chapitre 1 Matériel et méthodes

 Tube 4 : Test de Badjet-Kedde: Addition de quelques grains d’acide picrique l’apparition d’une coloration orange montre des stéroïdes laconiques.

I.2.3.

Détection des saponosides :

Pour l’identification rapide d’un organe a saponosides, il suffit de mettre en évidence leur pouvoir aphrogéne en observant la mousse très fine qui se forme après une simple agitation énergique (pendant 15 secondes) de cette poudre en présence d’eau distillé et sa persistance au moins 10 min., 1 g de poudre végétal est introduit dans des tubes avec 10 ml d’eau distillée puis on chauffe le mélange au bain marie à 85°C Pendant 20 min, après on agite vigoureusement chaque tube, en position horizontale pendant 15 secondes environ portoir, après 10 min au repos on compare les hauteurs des mousses.

- Pas de mousse : test négatif.

- Mousse moins de 1cm : test faiblement positif.

- Mousse de 1 à 2cm : test positif.

- Mousse plus de 2cm : test très positif.

2.4.

Evaluation de l'activité anti-inflammatoire : a. Matériel végétal :

Le matériel végétal est constitué de2 extraits hydro-méthanoliques, feuilles et fruits de Myrtus communis L.

b.Matériel animal :

Des rats adultes males de souches Wistar dont le poids est compris entre 357 et 210 g ont été utilisés pour cette étude. Ces rats ont été élevés à l'animalerie de l’université des frères Mentouri.

Les rats ont été placés dans des cages étiquetées transparentes en polypropylène ou chaque cage regroupait 4 lots homogènes de 4 une semaine avant l’étude pour leur permettre une adaptation aux nouvelles conditions du milieu. (Epa et al., 2015), et vivait a une température ambiante de 20 à 24°C, avec un cycle de 10/14 h (lumière/obscurité), et disposais d’un libre accès à la nourriture et à l'eau de robinet, La litière utilisée est de la sciure renouvelée 3 fois par semaine pour garder le bon conditionnement hygiénique des rats.

Chapitre 1 Matériel et méthodes

Figure 24 : Rats adultes de souche wistar.

c. Réactifs :

Solution de formol 1% dans l’eau physiologique, extraits EMPL feuilles et EMMR, acide 2-[2-(2,6-dichlorophenyl)amnophényl] éthanoïque (diclofenac) comme anti-inflammatoire de référence.

 Protocole expérimentale :

L'œdème est provoqué par l'injection dans l'aponévrose de la plante du pied d’une solution de formol à 1% [1]. Selon laquelle l’inflammation est induite par injection de formol au niveau de la voûte plantaire de la patte droite du rat. L’œdème causé par cet agent phlogogène sera traduit en volume et mesuré par le Pléthysmomètre ce qui permet de suivre l’évolution du processus inflammatoire. Pour chaque essai de l’activité anti-inflammatoire, trois lots de trois souris ont été utilisés. Ces souris ont été mises à jeun, 17 heures avant l’essai (Epa et al., 2015) Lot témoin : Les rats de ce lot reçoivent 4 ml/kg de la solution véhicule (eau physiologique) par voie intra-péritonéale (ip), 30 mn avant l’injection de 0.04 ml de formaldéhyde 1% dans la voûte plantaire de la patte droite du rat.

Chapitre 1 Matériel et méthodes

Figure 25: Injection des rats par voie intra-péritonéale.

Lot référence : Les rats de ce lot ont été traités par voie (ip) avec un anti-inflammatoire utilisé en thérapeutique, 30 mn avant l’injection du formol, l’administration de l’anti-inflammatoire se fait à raison de 25mg/kg.

Lot essai : L’extrait à tester est administré aux souris par voie (ip) à raison de 200 mg/kg ; 30 mn avant l’injection du formol.

Le suivi de l’évolution de l’œdème se fait par mesure des deux pattes : une patte traitée P(t) et une patte non traitée P(nt), et ceci à 0. 30, 60, 120, 180 mn après injection du formol.

L’activité anti-inflammatoire des produits testés et son évolution ont été estimés par la détermination des pourcentages moyens d’inhibition de l’œdème, calculés suivant la formule.

% d'inhibition = 100 x (Vt-V0) témoin - (Vt-V0) traité/ (Vt-V0) témoin - V0 représente le volume de la patte à t=0 (avant injection du formol), - Vt représente le volume de la patte à un temps (t) quelconque.

2.5.

Evaluation de l’activité antidiabétique :

I.2.5.1.Test de tolérance au glucose (OGTT = oral glucose tolérance test) :

Test de tolérance au glucose par voie orale est l’index dérivés L’OGTT (ou Hyperglycémie Provoquée par voie Orale, HGPO) est un test simple, utilisé en routine clinique.

Après une nuit de jeûne, des échantillons de sang, pour détermination des concentrations de glucose et de l’insuline, sont prélevés à 0, 30, 60 et 120 minutes après une charge orale de glucose (75 g) chez l’humain). La tolérance au glucose est reflétée par l’efficacité de l’organisme à faire diminuer la glycémie après une charge en glucose. (Choukem et Gautier, 2008) .

Chapitre 1 Matériel et méthodes

47 a. Matériel végétal :

Extraits hydrométhanoliques de feuilles et fruits de myrte commun, préalablement préparés par macération.

b. Matériel animal :

Des rats adultes males de souches Wistar dont le poids est compris entre 253 et 200 g, ont été utilisés pour cette étude, ces rats ont été élevés à l'animalerie de l’université des frères Mentouri.

Les rats ont été placés dans des cages transparentes en polypropylène ou chaque cage regroupait 4 lots homogènes de 4 individus chacun, et vivait a une température ambiante de 20 à 24°C, avec un cycle de 10/14 h (lumière/obscurité), et disposés d’un libre accès à la nourriture et à l'eau de robinet, La litière utilisée est de la sciure de bois, renouvelée 3 fois par semaine pour garder, le bon conditionnement hygiénique des souris.

c. Réactifs :

 Solution de glucose 2g/1000g dans du sérum physiologique, extraits méthanoliques des EMMC feuilles et EMMC fruits de myrte : 200mg/kg

 Du bionorm comme antidiabétique oral de référence a raison de 0.5mg/1000g

 L’eau physiologique 250mg/kg comme substance témoins.

I.2.5.2. Induction du glucose :

Pour évaluer l’activité antidiabétique de l’extrait de Myrtus communisL., un diabète sucré similaire au diabète de type II a été induit par gavage d’une dose unique de glucose à raison de 2g/1000g de poids corporel aux rats mis à jeun pendant environ 16 heures.

Figure 26

:

Gavage d’une dose unique de glucose à raison de 2g/1000g de poids corporel.

Chapitre 1 Matériel et méthodes

 Protocole expérimentale :

Avant le test, les souris ont été mises à jeun pendant 16 heures.

Dans ce model expérimental, 4 lots homogènes de 4 rats male Swiss Albinos par gavage au glucose .

- Le groupe 1 (control normal) reçoit un gavage avec de l’eau physiologique NaCl 0.9 % à raison de 250mg/kg, avant 30 min de l’administration de glucose.

- Le groupe 2 (control diabétique) reçoit un gavage de bionorm à raison de 0.5mg/kg avant 30 min de l’administration de glucose.

- Les groupes 3 et 4 reçoivent respectivement un gavage unique des deux extraits EMMC feuilles et fruits de Myrtus communis L. à raison de 200mg/kg.

- L’eau physiologique, le bionorm et extraits feuilles et fruits ont étaient administré aux 4 groupes de rats à t-30min .

Les souris ont ensuite reçu le glucose de 2g/kg de poids corporel d'une solution de glucose à 100 mg / ml administré par gavage lui aussi a t0 soit âpres le prétraitement en eau physiologique, bionorm et extrait EMMC feuilles et fruits respectivement.

Le glucose sanguin a été mesuré a t :-30min, t : 0, 30min, 60min, 120min, 180min.

L’évaluation du taux glucose sanguin est faite à l’aide d’un glucomètre et des bandelettes adaptées (accu-chek active, Roche) le sang est prélevé au niveau de la veine principale de la queue (obtenu par une coupe de 2mm).

Chapitre II

Résultats et discussion

Chapitre 2 Résultats et discussion

49 II. Résultats et discussion

II.1. Screening phytochimique :

Les tests phytochimiques réalisés sur différents organes de l’espèce étudiée Myrtus communis L., afin de caractériser les groupes de métabolites secondaires. Ces réactions sont basées sur des phénomènes de précipitation ou de coloration par des réactifs spécifiques.

II.1.1. Criblage des composés phénoliques:

a. Criblage des Quinones :

Le criblage phytochimique, par le réactif spécifique NaOH a montré que les tiges et fruits de l’espèce étudiée Myrtus communis L. sont moyennement riches en quinones.

b. Criblage des Anthraquinones :

Le réactif KOH utilisé pour la détection des anthraquinones dans les extraits chloroformiques des organes étudiés (tiges, feuilles et fruits) ne contiennent pas des anthraquinones .

c. Criblage des flavonoïdes :

La mise en évidence des flavonoïdes dans les extraits méthanoliques de l’espèce Myrtus communis L. est confirmée par l’apparition d’une couleur rouge intense dans tous les organes étudiés ce qui indiquent l’abondance de cette plante en ces métabolites secondaires, ce qui est similaire, avec les travaux rapportés par Baytop et al, ( 1999) et qui ont montré également que les feuilles de myrte commun contiennent des tanins et des flavonoïdes, Figure 27 .

a. Feuilles b. tiges c. fruits Figure 27: Photographies des tests des flavonoïdes.

Chapitre 2 Résultats et discussion

50 d. Criblage des Anthocyanes :

Le criblage phytochimique des anthocyanes a révélé une forte concentration de ces molécules dans les feuilles et fruits de l’espèce Myrtus communis L. les mêmes tests ont révélé la présence d’une faible concentration en anthocyanes dans les tiges de cette plante.

Tableau 05 : Résultats du criblage des composés phénoliques de Myrtus communis L.

L’espèce . Myrtus communisL.

Organes tiges feuilles fruits

Quinones libres ++ _ ++

Anthraquinones

Flavonoïdes +++ +++ +++

Anthocyanes +++ +++ +++

Tanins condensés +++ +++ +++

- : Réaction négative

+ : Réaction faiblement positive ++ : Réaction moyennement positive

+++ : Réaction fortement positive e. Criblage des tanins :

L’apparition d’une couleur bleu noirâtre intense dans les extraits hydro-méthanoïques des feuilles, tiges et fruits du myrte avec le FeCl3indique que les feuilles, tiges et fruits de la plante Myrtus communis L. sont riches en tanins galliques.

Chapitre 2 Résultats et discussion

a. Feuilles b. tiges c. fruits Figure 28 : Photographies de mise en évidence des tanins.

f. Criblage des stérols stéroïdes et triterpènes :

Nos travaux de criblage, ont montré que le Myrte commun, est très riche en stérols insaturés et stéroïdes, surtout les fruits. Les stérols et triterpènes sont fortements présents dans les tiges et fruits et moyennement positif dans l’extrait méthanolique des feuilles, De même pour les stéroïdes lactoniques, qui sont moyennement abondants dans les trois organes de la plante.

Tableau(6).

Tableau 06 : Résultats de criblage des stérols, stéroïdes et triterpènes de myrte.

Organes Molécules

Feuilles Tiges Fruits

Stérols insaturé +++ +++ +++

Stéroïdes et triterpenes

+++ ++ +++

Stéroïdes lactoniques

++ ++ ++

Chapitre 2 Résultats et discussion

Figure 29 : Photographies des criblages des stérols, stéroïdes et triterpenes du myrte.

II.2. Activité anti-inflammatoire :

II.2.1. Criblage de l’activité antioedémateuse :

L’étude a été conçue in vivo pour évaluer l'activité anti-inflammatoire des extraits des feuilles et fruits de la plante M. communis, à la dose de 20 mg/kg en administration par voie intra-péritonéale. Les expériences sont réalisées sur le modèle de l'œdème de la patte des rats induit par le formol 1%, les résultats obtenus ont été comparés à ceux d’un médicament le diclofenac qui est un anti-inflammatoire non stéroïdien et à ceux du contrôle négatif (eau physiologique).

Après l’injection de l'eau physiologique, le formol entraîne une augmentation significative du volume de la patte des rats de 0, 33±0,005, 0,45±0,01, 0,42 ±0,01 et 0,42

±0,02 à 30 mn, 60 mn et 120 mn et 180mn. Respectivement.

L’injection du diclofenac à la dose de 10 mg/kg par voie i-p prévient de façon significative l'augmentation du volume de la patte du rat. Elle est de 0,2±0,02, 0,2±0,01, 0,2±0,005 et 0,27±0,005 de 30, 60, 120, 180 mn.

En ce qui concerne l’extrait EMMC feuilles a fortement inhibé l’évolution du volume de l’œdème de la patte du rat, de ce fait cet extrait a montré une efficacité anti-inflammatoire plus meilleur que celle du médicament, le diclofenac. Les valeurs d’inhibitions enregistrées

Chapitre 2 Résultats et discussion

sont de 0,1±0,011, 0,015±0,010, 0,05±0,01 et 0,15±0,01 pendant le temps .30, 60, 120 et 180 mn. Après 30 mn de l'injection du formol.

Par contre l’extrait EMMC fruits a montré une activité anti-inflammatoire modéré avec des pourcentages d’inhibitions des volumes de l’œdème de : 0,15±0,017, 0,3±0,012, 0,45±0,014 et 0,42±0,010 pendant les temps 30, 60, 120 et 180 mn, figure 30.

Figure 30 : Courbe de l’évolution de l’œdème en présence d’un prétraitement par voie intra péritonéale, après l’injection de formol 1%.

L'évaluation du pourcentage d'inhibition montre que l'extrait EMMC feuilles de M.

communis, possède une activité anti-inflammatoire, plus efficace et importante que celle de l’extrait EMMC fruits. Et cela, peut se traduire par le genre de molécules, que contiennent les feuilles.

Les résultats montrent clairement l’effet de l’extrait méthanolique des feuilles du myrtus communisL. , qui possède un potentiel anti inflammatoire avec une concentration de 20

mg /kg qui a un meilleur effet, l’extrait a montré des propriétés analgésiques en comparaison avec le Diclofenac de sodium.

Chapitre 2 Résultats et discussion

54 II.3.1. Résultats et évolution de la glycémie :

Les résultats expérimentaux, obtenus de l’effet antidiabétique de l’extrait EMMC feuilles et fruits du Myrtus communisL. Sur des souris ayants une hyperglycémie sanguine sont illustrés dans les tableaux (7):

Tableau 7: Résultats du taux de glycémie.

lots rats poids Dose a

Chapitre 2 Résultats et discussion

Les résultats de l’effet antidiabétique de l’extrait EMMC feuilles du Myrtus communis L. sur des souris ayants une augmentation de la glycémie sanguine durant 180min de

traitement à une dose de 200mg/kg de poids corporel sont illustrés par la figure 31.

Figure 31 : Graphique représentatif du taux de glycémie des rats traités par eau physiologique, bionorm et extraits feuilles et fruits de Myrtus communisL.

II.3.2. Discussion :

L’analyse des résultats montre une diminution progressive de la glycémie chez les souris ayants une hyperglycémie sanguine traités par les extraits méthanoliques des feuilles et fruits de M.communisL. À une dose de 200mg/kg et cela du début jusqu’à la fin de l’étude de 1.56g/L jusqu’à 0.88g/L pour l’extrait des fruits et de 1.55g/L jusqu’à 0.82g/L pour l’extrait des feuilles.

A t0 de l’injection du glucose, la glycémie moyenne des rats non traitées (normal eau physiologique) a raison de (250mg/kg) est de l’ordre de 1.17g/L, tandis que la glycémie moyenne des rats traitées avec l’antidiabétique référence bionorm (0.5mg/1000g) est de 0.6g/L, on peut constater que la différence est flagrante ce qui prouve sans aucun doute l’effet du médicament déjà utilisé sur le marché.

Chapitre 2 Résultats et discussion

Notre plante Myrtus communisL. Se place au milieu des deux lots précédents avec un taux de glycémie moyen de 1.04g/L pour l’extrait des fruits et 0.89g/L pour l’extrait des feuilles

A t+30min les quatre lots observent un pic considérable de 1.72g/l pour le lot témoins 1.56g/l pour le lot fruits 1.55g/l pour le lot feuilles et 0.93g/l pour le lot référence.

De t+60min jusqu'à la fin de l’étude t+180min :Les quatre lots montrent une diminution progressive du taux de glycémie avec 0.6g/l comme donnée de référence, 0.82g/l pour les rats traités avec l’extrait de feuilles et 0.88g/l pour les rats traité avec l’extrait de fruits, le lot normal est le moins quotté avec 0.94g/l .

Si l’on devait comparer les deux extraits EMMC feuilles et fruits de myrte commun, on trouve que les feuilles s’avèrent plus efficace sur le plan hypoglycémique que les fruits, en général l’effet hypoglycémiant des deux extraits restent satisfaisants .

Conclusion générale

Conclusion générale

57 Conclusion générale :

La connaissance et l’usage des plantes médicinales constituent un vrai patrimoine de l’être humain. Leur importance dans le domaine de la santé publique est très accentuée dans ces dernières années grâce aux thérapeutiques qu’elles procurent. Cette diversité en propriétés biologiques est liée certainement aux vertus thérapeutiques attribuées à une gamme extraordinaire de molécules bioactives synthétisées par la plante non seulement comme des agents chimiques contre les maladies, les herbivores et les prédateurs mais aussi comme des agents médicinaux tels que les antidiabétiques et anti-inflammatoires. Ces molécules naturelles de type phénolique sont très recherchées en phytothérapie vue les effets secondaires des médicaments.

C’est dans ce contexte, que nous avons eu la réflexion, d’aborder nous nous sommes intéressés à l’une des plantes médicinales, largement répandue en Algérie, le myrte commun, cueillis à Chakfa, wilaya de Jijel, appartenant à la famille des myrtacées, très utilisée en colorimétrique de Sanglethon et Ross a confirmée l’abondance des feuilles et fruits de myrte en composés phénoliques.

La présence des composants précédents due à leur rôle important dans la plante, dont ils

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