Maintenant que la justification du projet a été exposée, les connaissances actuelles sur le méca- nisme de fusion servant de base au projet peuvent être présentées. Cette section décrit la fusion membranaire en détail, en commençant par présenter les membranes et les phospholipides qui les composent.
1.5.1 Membranes
Phospholipides
Les principaux constituants des membranes cellulaires sont les phospholipides. Les phospholi- pides sont des molécules amphiphiles composées d’acides gras et de groupements phosphates, souvent reliés à un alcool polaire [94,95]. Sauf pour certaines exceptions, les acides gras sont reliés au phosphate par un glycérol. La figure 1.7 présente la structure de certains phospho- lipides importants dans la constitution des membranes eucaryotes, bactériennes et modèles. La nomenclature des phospholipides se base sur la position des groupements par rapport au glycérol (noir dans la figure 1.7). Dans le 1-palmitoyl-2-oléoyl-3-sn-phosphatidylcholine par exemple, la position 1 du glycérol est estérifiée avec un acide palmitique, la position 2 avec un acide oléique et la position 3 avec une phosphatidylcholine. La notation sn signifie que la nomenclature du composé suit la numérotation stéréochimique, établie afin de distinguer les différents stéréoisomères [96]. Puisque tous les phospholipides contenant un glycérol présen- tés ci-dessous sont estérifiés avec un acide gras en position 1 et 2, et liés à un phosphate en position 3, une nomenclature simplifiée est utilisée. Ainsi, la figure 1.7présente le palmitoyl-
oléoyl-phosphatidylcholine (POPC), le palmitoyl-oléoyl-phosphatidyléthanolamine (POPE), le dipalmitoyl-phoshatidylsérine (DPPS), le palmitoyl-oléoyl-phosphatidylinositol (POPI), le palmitoyl-sphingomyéline (PSM), le palmitoyl-oléoyl-phosphatidylglycérol (POPG) et dodé- cylphosphatidylcholine (DPC).
Figure 1.7: Structure de phospholipides d’intérêt. Têtes polaires incluant les phosphates en bleu. Glycérols en noir. Acides gras en vert. Pour le PSM, la sphingosine remplaçant le glycérol est en rouge. La tête polaire du PSM peut être une choline, telle qu’illustrée, ou une éthanolamine. Image construite à l’aide du logiciel libre BKChem [97].
Dans les cellules épithéliales, cibles du virus Influenza, les phospholipides contiennent des têtes polaires de phosphatidylcholine (PC) (∼ 50 %), sphingomyéline (SM) (∼ 20 %), phosphati- dyléthanolamine (PE) (∼ 15 %), phosphatidylinositol (PI) (∼ 10 %) et phosphatidylsérine (PS) (∼ 5 %). Les têtes polaires de PI et PS sont chargées négativement, alors que celles de PC, PE et SM sont zwitterioniques. Les acides gras auxquelles ces têtes sont reliées sont principalement les acides oléiques avec 18 carbones et une insaturation au 9e carbone (∼ 26 %) ou au 7e carbone (∼ 7 %), l’acide palmitique avec 16 carbones saturés (∼ 23 %), l’acide stéarique avec 18 carbones saturés (∼ 15 %) et les acides palmitoléiques avec 16 carbones et une insaturation au 7e carbone (∼ 5 %) ou au 9e carbone (∼ 3 %) [98,99].
Les phospholipides POPC, POPE, DPPS, POPI et PSM, illustrés à la figure1.7, sont parmi les principaux phospholipides retrouvés dans les membranes épithéliales [100] et les membranes des cellules hôtes d’Influenza [98]. Les phospholipides POPG et DPC sont quant à eux utilisés dans les membranes modèles lors d’expériences in vitro. Une composition lipidique souvent utilisée pour modéliser les membranes cellulaires eucaryotes est celle contenant des POPCs et des POPGs dans des proportions de 4 pour 1. En effet, les POPGs possèdent une charge électrostatique totale négative, tout comme les phospholipides ayant des têtes de PI ou PS qui composent ensemble environ 15 % des phospholipides membranaires [101]. Il est toutefois à noter que les POPGs ne se retrouvent habituellement pas dans les membranes de cellules eucaryotes, mais plutôt dans celles des bactéries [102].
Figure 1.8: Phases lipidiques. Les têtes polaires sont représentées par des cercles et les chaînes grasses par des traits ondulés. Tiré de [103].
Phases lipidiques
Les phospholipides ont un caractère amphiphile, présentant une partie hydrophile (tête po- laire) et une partie hydrophobe (chaînes grasses). En solution aqueuse, les phospholipides s’as- semblent spontanément pour regrouper leurs parties hydrophobes et minimiser les contacts des chaînes grasses avec l’eau. Cet assemblage forme différentes structures, appelées phases lipidiques. Les principales phases lipidiques sont les phases lamellaire, hexagonale, micellaire et cubique, illustrées à la figure 1.8. Les membranes, soit les bicouches phospholipidiques, cor- respondent à la phase lamellaire. En phase hexagonale, les chaînes grasses se rassemblent au centre de structures en tubes, entourées des têtes polaires et du solvant aqueux. Dans la phase micellaire, les phospholipides forment des sphères, aussi avec les chaînes grasses vers le centre et les têtes polaires pointant vers l’extérieur de la sphère. La phase cubique permet différentes structures périodiques relativement complexes [103]. À concentration phospholipidique élevée, les phases hexagonales et micellaires s’inversent, séquestrant le solvant aqueux au centre des structures et dirigeant les chaînes grasses vers l’extérieur des structures. La phase d’une solu- tion lipidique dépend de plusieurs facteurs, dont la longueur des chaînes lipidiques, la taille de
la tête polaire, la concentration de lipides, la température, la pression, la concentration d’ions et le pH [103,104].
Les phases lipidiques ne concernent pas seulement l’assemblage des lipides, mais aussi leur dynamique individuelle. Lorsque la température est basse, les chaînes grasses sont rigides et les phospholipides sont alors dans la phase gel β. Lorsque la température monte au-dessus de la température de transition Tm (l’indice m provient de l’anglais « melting » ), les chaînes
grasses deviennent mobiles et les phospholipides adoptent la phase dite cristal liquide α [105], telle qu’illustrée à la figure1.9. Toutefois, les lipides en phase lamellaire gel se retrouvent plus
Figure 1.9: Phases lamellaires gel Lβ et cristal liquide Lα. Adapté de [105].
souvent en phase Lβ0, où les chaînes grasses des phospholipides sont inclinées par rapport à la normale à la membrane plutôt que parallèles. Les phases gel et cristal liquide se retrouvent à travers les phases d’assemblage précédemment présentées. Les phospholipides peuvent donc être dans la phase lamellaire cristal liquide Lα, lamellaire gel Lβ, hexagonale cristal liquide Hα, etc.
Membranes cellulaires
Les membranes cellulaires sont composées de phospholipides dans la phase Lα. Ceci est possible
puisque les POPCs, principaux phospholipides des membranes cellulaires eucaryotes [100,106], ont une température de transition Tm d’environ −2,5◦C [107]. Les membranes cellulaires ne sont cependant pas composées uniquement de phospholipides. Selon le modèle de la mosaïque fluide [108], ces membranes contiennent aussi un grand nombre de protéines, oligosaccharides et autres molécules organiques nécessaires aux fonctions membranaires, tels qu’illustrés à la figure1.10.
Certains phénomènes impliquant les membranes cellulaires peuvent être étudiés in vivo, entre autres par des méthodes de microscopie et de fluorescence. Ces outils permettent d’explorer par exemple la localisation de protéines membranaires [110] et la déformation des membranes [111] à l’échelle cellulaire.
Figure 1.10: Schéma d’une membrane cellulaire eucaryote. Adapté de [109].
Membranes modèles
Les membranes modèles sont utilisées dans les études visant à comprendre précisément l’in- teraction entre une protéine donnée et les membranes. Ces membranes artificielles simplifiées sont composées uniquement de phospholipides et possiblement de quelques autres molécules simples tel le cholestérol. Elles peuvent être préparées en laboratoire et ne nécessitent aucune culture cellulaire. De plus, les membranes modèles fournissent un environnement contrôlé, à l’inverse des membranes cellulaires où une panoplie de macromolécules peuvent interférer avec les mesures. Cependant, certains phénomènes surviennent dans les membranes cellulaires grâce à l’interaction des nombreuses macromolécules présentes, et ne sont pas observables dans les membranes artificielles. Par exemple, le cytosquelette participe à la diffusion des lipides et des protéines à la surface des cellules et est absent dans les membranes modèles [112].
La figure 1.11 présente différentes structures de membranes artificielles. La première struc- ture illustrée, la micelle, est la membrane artificielle la plus simple et est constituée d’un assemblage de phospholipides dans la phase micellaire. La seconde structure, la bicelle, est une bicouche phospholipidique en phase lamellaire formant une surface plane. Les extrémités de la bicelle contiennent de phospholipides à courte chaine (rouge foncé, figure 1.11B), tels les dihexanoyl-phosphatidylcholine (DHPC) [113–115]. La structure suivante, la vésicule, est aussi formée d’une phase lamellaire, mais est recourbée sur elle-même pour former une sphère. Le centre de la vésicule contient du solvant aqueux, vers lequel sont orientées les têtes polaires de la couche lipidique intérieure de la vésicule. Une bicouche peut aussi être supportée sur un support hydrophobe comme le Teflon (polytétrafluoroéthylène, PTFE) [116], telle qu’illus-
trée à la figure 1.11D. Ensuite, la monocouche, aussi appelée monocouche de Langmuir, est obtenue en déposant des phospholipides à la surface d’une couche d’eau. Les phospholipides s’orientent alors pour exposer les têtes polaires vers le solvant aqueux et les chaînes grasses à l’air [117]. Finalement, la membrane in silico est un modèle théorique permettant de simuler le comportement des membranes par informatique [118]. Le modèle de la membrane in silico est celui utilisé dans ce projet.
Figure 1.11: Structures de membranes artificielles utilisées dans l’étude expérimentale et théorique des membranes [115].
Chacun des modèles membranaires présentés au paragraphe précédent est approprié à l’étude de phénomènes membranaires particuliers. La dynamique des protéines membranaires et leur interaction avec les phospholipides membranaires peut être étudiée par spectroscopie RMN dans les micelles [119, 120]. Les bicelles sont aussi utilisées avec les protéines membranaires, mais sont préférées aux micelles pour l’étude de protéines susceptibles d’être affectées par la forte courbure de la surface des micelles [115, 121]. De plus, les bicelles peuvent être pla- cées dans une orientation particulière par l’application d’un champ magnétique pour faciliter
l’étude de l’orientation des protéines par rapport aux membranes [113,114]. Les vésicules sont utilisées pour analyser les perturbations membranaires induites par les protéines et peptides telles la perméabilisation [122], et la fusion membranaire [123,124]. Les bicouches sont souvent utilisées dans l’étude du potentiel électrique membranaire et des canaux ioniques [116]. Les monocouches peuvent être utilisées dans l’étude de l’interaction protéine-membrane, notam- ment par la mesure des changements de pression latérale induite par l’insertion de protéines dans la monocouche [125–127]. Les membranes in silico permettent d’analyser les détails ato- miques de l’interaction entre les protéines et les membranes et fournissent des informations complémentaires aux données expérimentales [118]. Les modèles membranaires in silico seront plus amplement décrits au chapitre3.
Structure des bicouches lipidiques
Tel qu’indiqué précédemment dans cette section, les membranes biologiques sont en fait des bicouches de lipides en phase Lα. L’assemblage de phospholipides en bicouches constitue une structure hétérogène. Cette structure peut être divisée en quatre régions distinctes [128] illus- trées à la figure 1.12A. La région I se trouve au centre de la membrane et est constituée uniquement de chaînes hydrophobes. La région II se trouve à la jonction entre les sections hydrophobes et polaires de membrane et contient des chaînes grasses et la portion initiale des têtes polaires. La région III contient principalement les têtes polaires, soit les phosphates char- gés négativement et les cholines chargées positivement dans le cas de la bicouche de dioleoyl- phosphatidylcholine (DOPC) illustrée la figure1.12A. La région IV comprend la fin des têtes polaires et le solvant aqueux entourant la bicouche.
Les propriétés de chacune des régions sont différentes. L’hydrophobicité est maximale dans la région I et diminue en s’approchant des têtes polaires et du solvant. Les molécules hydro- phobes ont donc tendance à se placer près du centre de la membrane. La densité varie aussi d’une région à l’autre telle qu’illustrée à la figure 1.12B. La densité maximale se trouve dans la région III, qui contient les têtes polaires. À l’inverse, la densité est minimale dans la région I constituée uniquement de chaînes carbonées. Ces différences de densité correspondent à la variation de la pression latérale selon l’axe normal à la bicouche. Tel qu’illustré à la figure
1.13, une forte pression négative existe à l’interface entre les têtes polaires et les chaînes hy- drophobe. Cette pression négative est compensée par une plus faible pression positive pour les chaînes hydrophobes et les têtes polaires. La pression positive des têtes polaires est due à leurs répulsions stérique et électrostatique, et aux forces d’hydratation [129]. La pression négative à l’interface est causée par la tension interfaciale crée à l’interface entre la région hydrophobe et la région polaire qui inclut les têtes polaires et le solvant. Finalement, la pression positive des chaînes grasses est due à leur encombrement stérique et à leur entropie conformationnelle [130].
Figure 1.12: Densité des différentes régions des bicouches lipidiques. Tiré de [128].
La force entropique
La force qui pousse les chaînes grasses à se regrouper lorsqu’elles sont en milieu aqueux, soit la force hydrophobe, est relativement complexe [131]. Cette force n’est pas dominée par les interactions Van der Waals entre les carbones des chaînes, contrairement à ce qui est parfois supposé [132]. L’effet hydrophobe classique est plutôt dominé par la force entropique provenant des molécules d’eau [133]. Les molécules d’eau font des ponts hydrogène forts entre-elles, mais pas avec les molécules hydrophobes. Lorsqu’une molécule hydrophobe est placée dans l’eau, certaines molécules d’eau voient une ou plusieurs de leurs voisines remplacées par la molécule hydrophobe. On pourrait croire que ceci implique le bris de ponts hydrogène entre les molécules d’eau. Ceci n’est pas le cas pour des molécules hydrophobes de la taille des phospholipides, puisque le réseau de ponts hydrogène de l’eau peut alors se réorganiser autour de la molécule hydrophobe [133]. Cependant, les molécules d’eau adjacentes à la molécule hydrophobe sont contraintes à se réorganiser et donc à faire leurs ponts hydrogène avec un nombre réduit de voisines. Leur liberté de mouvement est limitée puisqu’elles ne peuvent plus orienter leurs
Figure 1.13: Profil de pression latérale des bicouches. Adapté de [130].
hydrogènes en direction de la molécule hydrophobe. La diminution de la liberté de mouvement implique une baisse considérable de l’entropie du système. Les mouvements thermiques des molécules d’eau appliquent alors une force sur la molécule qui contraint leur liberté, soit la molécule hydrophobe. Lorsque deux molécules hydrophobes en solution aqueuse se rencontrent, cette force entropique les pousse à rester en contact. L’effet hydrophobe peut donc être perçu comme l’augmentation d’entropie survenant lorsque les molécules hydrophobes se regroupent, diminuant leur surface de contact avec l’eau.
Bien que l’assemblage de chaînes grasses soit dominé par l’entropie, l’enthalpie y joue aussi un rôle. Les molécules d’eau forment un angle de 104.5◦ entre leurs atomes H-O-H, très près de l’angle tétraédrique de 109.5◦ caractéristique du réseau de ponts hydrogènes formé dans la glace, et partiellement conservé dans l’eau liquide [134]. Lorsque des molécules hydrophobes s’assemblent en une structure trop large (> 20 Å de diamètre), l’angle formé par les molécules d’eau devrait s’élargir pour pouvoir contourner la structure hydrophobe. Or, cet angle est très peu flexible et une fraction des possibilités de ponts hydrogène est alors perdue, entraînant une contribution enthalpique défavorable à l’ajout d’autres molécules hydrophobes à l’assemblage [133]. Cette contribution enthalpique reste moins forte que la contribution entropique décrite au paragraphe précédent, et est mitigée par l’interaction des têtes polaires avec l’eau dans le cas des phospholipides.
1.5.2 Mécanisme de fusion
La fusion membranaire est absolument nécessaire à l’infection du virus Influenza. Tel que présenté à la section1.2.3, la fusion a lieu entre la membrane virale et la membrane endosomale de la cellule infectée. Lorsque deux membranes ou deux vésicules sont mises en contact, elles ne fusionnent pas naturellement. En effet, les forces répulsives de fluctuation et d’hydratation, d’origine entropique et électrostatique, tendent à conserver une mince couche d’eau entre les deux membranes [135,136]. Ces forces induises des barrières d’énergie devant être surpassées
pour que la fusion surviennent. La fusion entre deux membranes se fait donc en plusieurs étapes dont certaines sont séparées par des barrières d’énergie importantes, telles qu’illustrées à la figure1.14. Lors d’une infection à l’Influenza, le passage des barrières d’énergie à la fusion est catalysé par la protéine virale HA, tel que présentée à la section 1.6. Les paragraphes suivants décrivent les différentes étapes de la fusion membranaire.
Figure 1.14: Schéma de la fusion membranaire adapté de [137] et profil d’énergie libre des étapes de fusion, adapté de [138]. L’état de transition limitant est indiqué par le symbole ‡ et correspond à la formation du pied. Aucune barrière d’activation n’est présente entre le pied et l’hémifusion, suivant l’hypothèse d’une transition spontanée entre ces deux états.
Avant la fusion, les membranes doivent être mises en contact (figure1.14, image de gauche). Une mince couche d’eau séparant les membranes est alors conservée [135, 136]. Les mono- couches faisant contact en provenance de chacune des membranes sont alors appelées couches proximales (figure1.14, vert ). Les monocouches opposées sont les couches distales (figure1.14, bleu).
La première étape de fusion est la formation du pied (figure1.14, seconde image), ou « stalk » en anglais. Cette étape requiert le mélange des lipides des couches proximales des deux mem- branes et est probablement le principal état de transition de la fusion membranaire. L’énergie d’activation de la formation du pied serait élevée, nécessitant une exposition des chaînes grasses à la couche aqueuse séparant les membranes [139, 140], jusqu’à ce que les chaînes des deux couches proximales se rejoignent.
suite à la formation du pied. La région où les deux couches distales entrent en contact peut varier en taille et forme un diaphragme. Si les deux membranes sont celles de vésicules, le contenu des deux vésicules reste séparé lors de l’hémifusion. Des calculs théoriques basés sur la tension membranaire indiquent que le pied serait métastable et que la transition du pied au diaphragme d’hémifusion serait spontanée [141,142]. Ceci est illustré par l’absence de barrière énergétique entre le pied et l’hémifusion à la figure1.14. À l’opposé cependant, certains auteurs suggèrent l’existence d’une énergie d’activation entre le pied et l’hémifusion [143,144]. L’ouverture du pore (figure 1.14, image de droite) s’effectue par le bris du diaphragme d’hé- mifusion et la formation d’une seule monocouche à partir des deux couches distales des mem- branes initiales. Les résultats de simulations de dynamique moléculaire indiquent que l’ouver- ture du pore implique une barrière d’énergie [138]. Cette barrière d’énergie peut être l’énergie nécessaire à la rupture du diaphragme d’hémifusion [145].
Tel que mentionné en début de section, le virus Influenza dispose d’un outil pour forcer la fusion entre sa membrane et celle de l’endosome de la cellule hôte. Cet outil est la protéine virale de surface HA, présentée dans la section suivante.