Fonctionnement

Le principe de mesure de l’optode repose sur le changement des propriétés de fluorescence d’un fluorophore spécifique de l’analyte ciblé. Les fluorophores sont immobilisés au sein d’une matrice polymère perméable à l’analyte (i.e. H⁺, O2, CO2,...), elle-même fixée sur un support (feuille polyester).

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On obtient alors un capteur plan d’une dizaine de micromètres d’épaisseur dont la face « support » peut être collée contre le plexiglas d’un rhizobox/rhizotron, de manière à mettre en contact les fluorophores avec le sol une fois le rhizobox/rhizotron fermé. Il existe des optodes fonctionnant sur un

principe de phosphorescence mais nous ne détaillerons pas leur fonctionnement ici, dans la mesure où mes travaux se sont concentrés sur des optodes fonctionnant sur un principe de fluorescence.

Un fluorophore est une molécule ayant la capacité (i) d’absorber des photons à une longueur d’onde particulière lors d’une phase d’excitation et de (ii) subséquemment réémettre des photons à une longueur d’onde plus élevée (spectre d’émission). La phase d’excitation fait passer les électrons dans un état excité alors que la phase d’émission correspond au retour de ces électrons à l’état fondamental. Entre ces deux phases a lieu un phénomène très rapide (10-12 secondes) pendant lequel une partie de l’énergie absorbée lors de l’excitation est perdue en chaleur : il s’agit de la relaxation vibrationnel des électrons excités. Le retour à l’état fondamental produit ainsi moins d’énergie que l’excitation n’en a consommée : les photons émis ont ainsi une énergie plus faible. La fluorescence émise est par conséquence d’une longueur d’onde plus élevée.

L’excitation des fluorophores se fait généralement par des LEDs qui présentent l’avantage d’avoir un champ d’émission étroit et un faible coût. Le spectre d’émission de la LED doit correspondre au spectre d’excitation du type de fluorophore utilisé.

Au niveau de ce que l’on mesure, deux cas existent : (1) la mesure de l’intensité de la fluorescence émise et (2) la mesure du temps de décroissance de fluorescence (fluorescence decay-time) du fluorophore.

La première méthode est présentée dans l’article de Blossfeld et al. (2013) et utilise une caméra comme détecteur. Les optodes PreSens utilisées dans cette thèse sont basés sur ce premier principe de fonctionnement. La seconde méthode est présentée dans l’article de Blossfeld et Gansert al (2007). Une fibre optique est utilisée pour la détection.

Mesure d’intensité de fluorescence : méthode ratiométrique et détection par caméra (CCD ou CMOS)

Le principe est basé sur la mesure de l’intensité de fluorescence émise lors du retour à l’état fondamental du fluorophore sensible au pH (dépendant de la concentration en analyte). Deux sources de problème peuvent cependant altérer la fiabilité et la répétabilité des mesures fondées sur l’intensité. La première source d’erreur est inhérente à l’optode et liée à sa qualité initiale – présence d’hétérogénéités de la concentration en fluorophores sur la matrice par exemple – et à sa conservation dans le temps – lixiviation des fluorophores dans la solution, détérioration de la qualité des fluorophores par photoblanchiment par exemple. La seconde source d’erreur est expérimentale et

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peut correspondre notamment à une fluctuation de l’intensité lumineuse des LEDs excitatrices ou encore à l’intensité lumineuse parasite autour de l’optode lors des mesures. Une approche appelée en anglais « Fluorescence Ratiometric Imaging Measurement » (FRIM) permet de pallier ces problèmes (cf planche 2). Cette méthode est fondée sur un couple de fluorophores ayant le même spectre d’excitation mais un spectre d’émission différent ; l’un est sensible au pH, l’autre non. Il s’agit du principe de fonctionnement des optodes PreSens utilisées pendant cette thèse ; prenons donc cet exemple pour l’expliquer. PreSens fournit une caméra CCD équipée de LEDs émettant dans le bleu (470nm) permettant d’exciter le couple de fluorophores et de capter la fluorescence émise. Le spectre d’émission du fluorophore témoin est capté par le canal rouge de la caméra alors que le spectre d’émission du fluorophore sensible au pH est capté par le canal vert de la caméra. Le canal bleu ne collecte lui aucune intensité lumineuse en raison d’un filtre placé derrière l’objectif. Toute l’intensité lumineuse collectée par la caméra se répartit donc entre le canal rouge qui a collecté l’émission produite par les fluorophores témoins et le canal vert qui a collecté l’émission produite par les fluorophores sensibles au pH. En procédant à un ratio entre les canaux vert et rouge, il est possible de compenser la plupart des interférences environnementales et les possibles altérations de l’optode au moment de la mesure.

Avec cette méthode, nous obtenons en sortie une image RVB (ie à 3 canaux : rouge, vert, bleu) d’intensité à laquelle doit être appliquée le ratio R/V. Une calibration nous permet de traduire les valeurs de ratio en valeur de pH (cf partie « calibration » de ce chapitre).

Mesure de décroissance de fluorescence : méthode DLR et détection par fibre optique

Le principe est basé sur la mesure du temps de décroissance de fluorescence du fluorophore sensible au pH. Or, le temps de décroissance de fluorophore de la plupart des indicateurs sensibles au pH est de l’ordre de la nanoseconde ce qui nécessiterait un matériel sophistiqué et cher pour être détecté. Une méthode pour pallier ce problème est, en anglais, « Dual Lifetime Referencing » (DLR), que nous traduirons par « mesure de double vie ». Cette méthode utilise un couple de luminophores ayant le même spectre d’excitation ; l’un est le fluorophore sensible au pH (avec un temps de décroissance de l’ordre de la nano seconde), le second, non sensible au pH a un temps de décroissance de l’ordre de la micro seconde. L’intensité de fluorescence est convertie alors en un retard de phase.

Une fibre optique polymère de 2 mm de diamètre est utilisé pour (1) transférer la lumière d’excitation (470 nm) aux luminophores de l’optode et (2) récupérer les signaux optiques. Un logiciel spécifique (CommLogging : PreSens GmbH) permet de convertir ces signaux en une valeur de pH (après renseignement des données de calibration).

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Nous obtenons ainsi en sortie directement une valeur de pH. Cependant cette valeur est calculée en moyennant les signaux émis par une zone de 2 mm² environ. Dans le cas d’une optode > 2 mm², c’est la répétition des mesures dans l’espace qui permet ensuite de recréer une carte du pH. Un bras peut être utilisé pour déplacer la fibre optique régulièrement et parcourir toute la surface de l’optode.