Fonctionnalisation de nanoparticules d’or

Les applications thérapeutiques des NPo ne peuvent être envisagées que si les nano-objets sont fonctionnalisés. En effet, il est souvent nécessaire d’assurer leur stabilité en milieu biologique, pour les rendre furtives, les adresser à la tumeur ou encore afin de les utiliser comme vecteurs de médicaments. La réalisation d'une étude quantitative et fiable nécessite la préparation de plusieurs types de NPo dont la concentration et la fonctionnalisation sont bien définie. Dans cette étude nous souhaitons, entre autres, quantifier l’impact de la fonctionnalisation sur l’effet radiosensiblisateur en dosant les espèces radicalaires produites en présence de NPo. Pour ce faire, nous avons synthétisé six types de nano-objets: les NPo non-fonctionnalisées précédemment décrites et établies comme référence, deux NPo fonctionnalisées avec du PEG (Figure III 6) de poids moléculaires 1000 et 4000 g.mol-1 (NPo@PEG1000 et NPo@PEG4000), deux NPo fonctionnalisées avec un PEG thiolé de masse moléculaire 3500 g.mol-1 et deux terminaisons différentes (NPo@PEG3500-NH2 et NPo@PEG3500-COOH), un type de NPo revêtu d’albumine sérique humaine (NPo@HSA).

Figure III 6 : Formule chimique du polyéthylène glycol (PEG). n représente le nombre de monomères.

En vue d’améliorer le temps de vie des NPo au sein du système de circulation sanguine, le PEG est de loin la fonctionnalisation la plus utilisée [Jokerst, 2011]. De plus, compte tenu de la force d’interaction entre le soufre et l’or, les PEG thiolés sont souvent choisis comme ligands. Néanmoins, les thiols sont connus pour être de bons capteurs de radicaux hydroxyle. Aussi, nous avons comparé dans notre étude, les NPo fonctionnalisées avec des PEG non thiolés et des PEG thiolés. Nous avons également varié la charge globale des nanoparticules : les PEG1000 et PEG4000, neutres ne devraient pas apporter de charge supplémentaire aux nanoparticules. Dans le cas des HS-PEG3500-COOH, une charge négative due à la présence d’anions carboxylate ou une forme neutre pourraient être observées en fonction du pH des solutions. Les HS-PEG3500-NH2 devraient quant à eux apporter une charge positive aux NPo. En résumé, nous avons choisi un panel de ligands de type PEG avec trois masses moléculaires, deux types de greffage et des charges différentes. Nous avons également choisi un ligand de type protéique : la HSA. Il s’agit de la protéine la plus abondante dans le plasma sanguin, puisqu’elle représente plus de 50% des protéines qui le composent. Lorsqu’une nanoparticule est introduite dans un fluide biologique, elle se recouvre alors d’une couronne de protéines contenant notamment de la HSA

[Dobrovolskaia, 2009]. La HSA a ainsi été choisie comme une fonctionnalisation d’intérêt dans cette étude, en effet, elle nous permet de mimer le milieu de culture cellulaire.

2. Caractérisation du recouvrement

Comme précédemment décrit, le diamètre des NPo a soigneusement été déterminé par MET et un cliché de NPo@S-PEG3500-NH2 est présenté Figure III 7. L’analyse d’un minimum de 300 objets par lot de NPo a conduit à des diamètres moyens compris entre 31,2 ± 3,6 nm pour les NPo@S-PEG3500-COOH et 33,3 ± 4,9 nm pour les NPo@ S-PEG3500- NH2, les NPo non fonctionnalisées ayant un diamètre de 32,4 ± 4,1 nm (Table III 3). Dans la suite de ce travail, nous considérerons donc que tous les types de NPo synthétisés possèdent la même taille de cœur d’or avec des distributions comparables.

Figure III 7 : Cliché de microscopie électronique et distribution de NPo fonctionnalisées avec du HS-PEG3500-NH2. Les clichés ont été

enregistrés avec un grossissement x 40 000 à 120 kV.

a. Spectroscopie UV-visible

Les spectres UV-visible des NPo présentent une bande plasmon bien définie avec un maximum à 531 nm dans le cas des NPo non-fonctionnalisées. La position de la résonance plasmonique est en accord avec un diamètre d’environ 32 nm. Sans surprise, lorsque l’on fonctionnalise, on observe un effet batochrome [Ghosh, 2004; Mulvaney, 1996], soit un décalage de la bande plasmon vers les hautes longueurs d’onde (Figure III 8, Table III 3). En effet, la résonance plasmonique dépend de l’environnement des NPo, elle est affectée par les interactions avec la surface d’or. Par exemple, pour les NPo@HSA, un déplacement vers le bleu de 6 nm est observé en accord avec la littérature [Goy-López, 2012]. Pour les NPo@S-PEG3500, le déplacement batochrome est particulièrement notable avec une longueur d’onde

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III.B. Résultats – Caractérisation de nanoparticules d’or fonctionnalisées

plasmon de 535 nm, probablement en raison de la forte interaction entre la fonction thiol et la surface d’or [Daniel, 2003; Hakkinen, 2012]. Ces déplacements caractéristiques nous donnent une indication confirmant la fonctionnalisation des NPo. Cependant, nous souhaitons avoir accès à l’épaisseur du recouvrement et à la quantité de ligands greffés: nous avons donc réalisé des analyses en DLS et FTIR.

Figure III 8: Spectres d’absorption UV-visible normalisés des nanoparticules fonctionnalisées. Les spectres des NPo@PEG1000 et des

NPo@PEG4000 (NPo@PEG) d’une part et des NPo@S-PEG3500-NH2 et NPo@S-PEG3500-COOH (NPo@S-PEG) d’autre part sont identiques.

b. Diffusion dynamique de la lumière

Les résultats présentés dans la Table III 1 donnent les valeurs des diamètres hydrodynamiques obtenus par mesure DLS pour tous les types de NPo fonctionnalisées. Le diamètre hydrodynamique comprenant à la fois le diamètre de la nanoparticule mais également sa fonctionnalisation et sa couche de solvatation, les différences observées entre les diamètres hydrodynamiques des NPo non-fonctionnalisées et fonctionnalisées fournissent une mesure de l’épaisseur des recouvrements. Cette dernière varie entre environ 2 nm pour les NPo@PEG1000 et 12 nm pour les NPo@S-PEG3500-NH2 (Table III 1).

Table III 1 : Diamètres hydrodynamiques et épaisseurs des recouvrements des NPo fonctionnalisées.

NPo NPo@PEG1000 NPo@PEG4000 NPo@S-PEG3500-NH2 NPo@S-PEG3500-COOH NPo@HSA

Diamètre

hydrodynamique (nm) ^{43,0 ± 2,8 47,6 ± 3,9 46,8 ± 2,7 66,6 ± 0,5 61,6 ± 1,7 58,9 ± 2,5}

Epaisseur du

Ces données donnent confirment la fonctionnalisation effective des NPo et seront corrélées à celles obtenues par les autres techniques de caractérisation dans le chapitre III.B.4. afin de donner une vision précise d’ensemble des caractéristiques des nanoparticules synthétisées.

c. FTIR

Pour des NPo fonctionnalisées, il était essentiel de s’intéresser à la quantité de ligands constituant le recouvrement de chaque type de NPo. Comme précédemment pour l’estimation de la quantité de citrate résiduelle en surface des NPo, la spectroscopie infrarouge FTIR a été utilisée pour déterminer le nombre de ligands présents à la surface des NPo. Pour cette étude, quel que soit le ligand, nous nous sommes focalisés sur la région caractéristique des modes d’étirements des C-H alkyles νCH3 et νCH2 entre 2750 et 3000 cm-1. Nous avons utilisé des gammes d’étalonnage de concentrations comprises entre 0,125 et 2 mM pour tous les PEG et entre 15 et 50 µM pour la HSA. Dans la Figure III 9 sont représentés à titre d’exemple les résultats obtenus pour les NPo@S-PEG3500-NH2. A noter que pour les nanoparticules PEGylées, une quantification complémentaire a été effectuée avec les modes d’étirements des groupes éther νC-O entre 1000 et 1200 cm-1 (avec un maximum à 1113 cm-1). Les deux analyses sont cohérentes.

Figure III 9 : Quantification par spectroscopie infrarouge du nombre de ligands HS-PEG3500-NH2. Gauche: Spectres FTIR des

NPo@S-PEG3500-NH2 et spectresde la gamme de calibration. Droite: Courbe de calibration correspondante (à droite) entre 0,25 et 2 mM. Les valeurs d’absorbance obtenues ont été soumises à un déplacement arbitraire sur l’axe des ordonnées.

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III.B. Résultats – Caractérisation de nanoparticules d’or fonctionnalisées

Table III 2 : Nombre de ligands par NPo déterminé par spectroscopie FTIR. Les valeurs données sont les moyennes et écarts types de 3

expériences indépendantes.

Ces analyses nous permettent d’estimer assez précisément le nombre de ligands par NPo qui sont répertoriés dans la Table III 2. Les résultats montrent que le nombre de molécules de PEG1000 et PEG4000 à la surface des NPo sont comparables. Nous constatons par contre la grande différence des nombres de molécules greffées à la surface des NPo@PEG et des NPo@S-PEG. En effet, on compte trois fois plus de HS-PEG3500-COOH et près de dix fois plus de HS-PEG3500-NH2 que de PEG4000. Concernant les NPo@HSA, environ 1400 protéines par nanoparticule sont dénombrées. Compte tenu de ces chiffres et de l’épaisseur du recouvrement, nous sommes en mesure de calculer le nombre de molécules ou d’atomes par unité de surface des NPo ou de volume de la couronne de fonctionnalisation, et donc d’extraire une densité atomique et moléculaire (Table III 3).

d. Zétamétrie

La mesure du potentiel zêta a été effectuée pour chaque type de NPo fonctionnalisée et les valeurs moyennes obtenues pour toutes les synthèses sont reportées Table III 3. Moyennant les barres d’erreurs, les valeurs de potentiels zêta obtenues sont très similaires, que les NPo soient fonctionnalisées ou non (en moyenne -50 mV), hormis pour les NPo@S-PEG3500-NH2. En effet, la valeur du potentiel zêta pour ce type de NPo est positive et égale à 17 ± 10 mV en raison des charges positives apportées par le groupement fonctionnel NH3⁺ en solution aqueuse à pH 4,5. Cette mesure positive nous permet encore de confirmer la fonctionnalisation des NPo et confirme l’ancrage du HS-PEG3500-NH2 à la surface des NPo réalisé majoritairement via les soufres. Autrement dit, la position extérieure des groupements amines est favorisée comme attendu en réalisant notre synthèse à 4°C [Xia, 2012].