Fonction du complexe durant la réparation des CDB

Nous proposons ici un modèle de la régulation de 53BP1, qui implique H2A et H4 à travers des interactions et des modifications incompatibles de la chromatine. Nous avons en effet identifié un nouveau substrat de TIP60 au sein de la chromatine: H2AK15ac et une compétition entre son ubiquitylation et son acétylation. De manière intéressante, l'acétylation de H2AK15 se comporte très différemment des autres résidus acétylés au sein de la chromatine en réponse à des dommages.

Alors que l'ubiquitylation de H2A inhibe TIP60 en bloquant l'interaction par EPC1, nos résultats suggèrent aussi une fonction de TIP60 dans la régulation de RNF168. En réponse à des dommages, le signal H2AK15ac augmente de façon diffuse dans le noyau et ne colocalise pas de façon évidente avec H2AX par immunofluorescence. Nous avons ainsi proposé un rôle de H2AK15ac dans la limitation de l'ubiquitylation de la chromatine par RNF168 en réponse aux dommages. TRIP12 et UBR5 sont nécessaires pour limiter l'activité de RNF168 et la diffusion de H2AK15ub (Gudjonsson et al., 2012). De plus, l'analyse des gènes sous-exprimés dans les cellules U2OS KO MBTD1 montre une corrélation avec la déplétion de UBR5 (chapitre 3; données non montrés, p=2,3.10-10_{). On peut donc se demander s'il}

existe une relation entre TIP60 et d'autres inhibiteurs de l'ubiquitylation par RNF168, comme OTUB1 (Nakada et al., 2010).

Pour confirmer le mécanisme de compétition, des expériences de ChIP à la cassure pourront être effectuées: 1) des ChIP anti-H2AK15ac dans des cellules transfectées avec un siRNA dirigé contre RNF168 et 2) à l'inverse des ChIP anti-H2AK15ub avec l'anticorps produit par le laboratoire Durocher dans un siRNA Tip60 (Fradet-Turcotte et al en préparation). Le signal H2AK15ac se situe relativement proche de la cassure, et on peut s'attendre à ce que le signal H2AK15ubi s'étende de chaque coté de la CDB dans les cellules transfectées avec un siTip60. D'autre part, si l'anticorps fonctionne en immunofluorescence, comment se comportent les foyers H2AK15ub? sont-ils plus gros et/ou plus nombreux? Les expériences de ChIPseq dans les cellules DIvA permettront aussi de confirmer qu'il existe une corrélation de l'acétylation et de l'ubiquitylation de H2AK15 avec RAD51 (RH) et XRCC4 (NHEJ) respectivement.

Nos analyses par spectrométrie de masse ont détecté l'acétylation de H2AK15 mais aussi de H2AK13 à partir d'histones endogènes de MEF (données non montrées; en collaboration avec le laboratoire d'Alain Verreault). On peut supposer que la lysine 13 est aussi un substrat de TIP60, et nous disposons à présent d'un outil pour y répondre grâce à un anticorps commercial récemment disponible. Également, il est possible que d'autres acétyltransférases catalysent l'acétylation de H2AK15 et possiblement K13. La meilleure candidate est p300/CBP qui cible H2A sur la lysine 5. Les ChIP anti-

H2AK15ac dans les DIVA après inhibition de TIP60 permettront écarter la possible implication d'une autre HAT in vivo.

Nous avons identifié de potentiels nouveaux substrats de TIP60 durant la réparation des CDB de l'ADN. En effet, PALB2 et BRCA2 sont acétylées in vitro par le complexe TIP60 (appendice 5). Dans un premier temps, nous avons établi plusieurs lignées dans le système d'édition du génome par ZFN (AAVS1) en K562 et avons purifié PALB2 par double affinité. Nous avons pu confirmer que PALB2 est bien acétylée in vivo sans être capable de valider les résidus identifiés in vitro par spectrométrie de masse. De plus, un lien direct avec TIP60 n'a pas encore été démontré expérimentalement, même si l'interaction de PALB2 avec MRG15 procure un lien fonctionnel évident. De manière intéressante, les résidus identifiés comme acétylés se situent sur les domaines d'interaction de PALB2 avec RAD51, BRCA1 et l'ADN. De plus, l'analyse de PALB2 acétylée in vitro par TIP60 a identifié la lysine 25, qui est ubiquitylée par KEAP1-CUL3-RBX1 in vivo (appendice 5; (Orthwein et al., 2015)). L'ubiquitylation de PALB2 bloque le recrutement de BRCA1, qui lui-même permet l'activation de la résection par CtIP. Cette ubiquitylation de PALB2 est ainsi spécifique de la phase G1 du cycle cellulaire (Orthwein et al., 2015). Ceci pourrait expliquer nos difficultés à détecter PALB2 acétylée dans nos purifications, qui ont été effectuées sur des cellules asynchrones (donc majoritairement en G1). À la lumière de ces nouveaux résultats, il sera donc pertinent d'effectuer des purifications de PALB2 à partir de cellules en G2, dans le cas où l'acétylation serait logiquement pro-HR. D'autre part, l'acétylation de K25 pourrait favoriser l'interaction avec BRCA1 et une compétition entre ubiquitylation et acétylation pourrait réguler les interactions de PALB2 avec ses partenaires. L'impact de l'acétylation et de l'ubiquitylation sur la multimérisation de PALB2 pourra aussi être étudié. De plus, MRG15 serait capable de lier la chromatine ubiquitylée via son MRG (Wu et al., 2011). On peut alors envisager que le domaine pourrait interagir également avec PALB2 ubiquitylée. Cette hypothèse pourra être testée via des expériences d'interaction

in vitro. De plus, nous avons identifié un site d'acétylation de MRG15 en complexe avec PALB2 au sein

du domaine MRG qui pourrait moduler leur interaction (appendice 5; données non montrées d'acétylation

in vitro de PALB2-MRG15 par TIP60)

Concernant BRCA2, l'acétylation se situe sur son domaine C-terminal à proximité de son NLS et du résidu phosphorylé par CDK (Esashi et al., 2005) (appendice 5). Cependant, nous n'avons pas été en mesure d'identifier des résidus par MS ou de confirmer son acétylation in vivo. Néanmoins, le fait que TIP60 puisse acétyler ces protéines, qui sont plus en aval dans la voie, semble suggérer que TIP60 jouerait une fonction plus tardive durant la réparation. Il est possible que TIP60 soit aussi un régulateur de la résolution des jonctions de Holliday à travers ses hélicases RUVBL1/2. En effet, RuvB est

responsable des mouvements des jonctions de Holliday durant la recombinaison chez la bactérie. Notamment, il est possible que TIP60 soit impliqué dans le remodelage de la chromatine sur le brin matrice à cette étape.

Nous envisageons également d'autres moyens de régulation de 53BP1 par TIP60. En effet, 53BP1 est acétylée in vivo sur plusieurs résidus au sein de son domaine FFR (1220-1711) responsable de l'accumulation en foyers de réparation (PhosphoSitePlus). L'un des résidus (K1626) se situe notamment au niveau de son domaine UDR (1604-1631) et à proximité du résidu phosphorylé par Aurora B en mitose (T1609). Cependant, des résultats préliminaires suggèrent que le domaine UDR n'est pas un substrat de TIP60 in vitro. Des expériences in vivo avec des mutants ponctuels mimant l'acétylation constitutive pourront être réalisées afin de savoir si ces modifications peuvent effectivement moduler l'accumulation de 53BP1 aux sites de dommages par immunofluorescence. L'implication de TIP60 ou d'autres KAT comme MOF devra être éclaircie.

Finalement, nous avons identifié DMAP1 comme une déméthylase de H4K20me au sein du complexe TIP60 (Bhat et al en préparation). De manière intéressante, DMAP1 cible H4K20me alors que son homologue EAF2 chez la levure cible H3K79me. L'activité de DMAP1 renforcerait ainsi le modèle d'inhibition de 53BP1 par TIP60 en provoquant la déméthylation de H4K20me2/3 vers la mono- méthylation pour favoriser la liaison de MBTD1 à la cassure par rapport à 53BP1. Notre modèle général va ainsi à l'encontre de la méthylation de novo de H4K20 à la cassure. Il y aurait donc une relation étroite conservée au cours de l'évolution entre NuA4 et RAD9 vs TIP60 et 53BP1 à travers la méthylation de la chromatine. Des expériences complémentaires seront nécessaires afin d'affiner le modèle d'inhibition de 53BP1 par TIP60, à travers la liaison de la chromatine, au cours de la réparation des CDB et du choix de voie de réparation (figure 5.1).