Fermentation

1 Fermentations d’hydrolysats et étude des inhibiteurs

Les fermentations sont effectuées dans des flacons en verre de 100 mL. L’ensemble du matériel non stérile utilisé est tout d’abord stérilisé à la vapeur par autoclave (15 min à 120 °C).

Vingt millilitres de solution à fermenter (hydrolysat ou solution synthétique) sont introduits dans le flacon. Cinq millilitres d’une solution de sulfate d’ammonium à 10 g/L et de sulfate de magnésium à 2 g/L sont ajoutés, comme source azotée. Le pH est alors ajusté à 4,5 à l’aide d’une solution de soude (20 g/L) ou d’acide sulfurique (20 g/L). Trois grammes de levures

S. cerevisiae Sigma Aldrich, sèches, sont ajoutés pour obtenir une concentration en levures

d’environ 10 g/L.

Le flacon est ensuite fermé hermétiquement avec un bouchon muni d’un septum et placé sous agitation dans une étuve régulée à 30°C. Si nécessaire, des prélèvements sont effectués à l’aide d’une seringue et d’une aiguille stérile à travers le septum. Le milieu de fermentation est alors filtré directement à l’aide d’un filtre seringue (membrane en nylon de porosité 0,45 µm) et congelé s’il n’est pas analysé directement.

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Les levures Sigma Aldrich utilisées ne sont pas livrées pures, mais sur un substrat. Or, une partie de celui-ci peut être fermenté. Pour évaluer l’éthanol produit provenant de ce substrat, et non du milieu de fermentation, des blancs sont effectués. Il s’agit de fermentations similaires aux précédentes, si ce n’est que le milieu de fermentation est composé uniquement d’eau distillée. Les quantités d’éthanol mesurées dans ces blancs sont alors retranchées aux mesures effectuées sur les autres fermentations.

2 Acclimatation des levures à un hydrolysat concentré

Constitution des milieux de culture

En plus de la souche de levure fournie par Sigma Aldrich, quatre autres souches ont été utilisées pour ces expériences. Ces souches ont été reçues sous forme de poudre sèche d’Equateur. Les cinq souches ont tout d’abord été mises en solution dans de l’eau distillée stérilisée, puis directement transférées dans des boites de Petri préalablement remplies d’un milieu composé de YPD et d’agar stérile.

Les boites de Petri sont placées plusieurs jours dans un étuve régulée à 30 °C. Solutions utilisées pour l’acclimatation

L’objectif est d’acclimater les levures à un hydrolysat concentré (contenant environ 100 g/L d’hexoses) en augmentant petit à petit la proportion d’hydrolysat présente dans leur milieu de fermentation. Deux solutions ont été préparées, l’une contenant l’hydrolysat et l’autre étant un milieu de fermentation optimal pour les levures.

L’hydrolysat utilisé provient d’une autohydrolyse 170 (cf. Tableau 50 ci-dessus). Il est ensuite concentré par évaporation afin de multiplier par 4 sa concentration en hexoses, puis il subit une hydrolyse secondaire selon la référence (d’après [173]). De l’acide acétique et du furfural est perdu durant l’évaporation. L’objectif étant de fermenter un hydrolysat concentré contenant l’ensemble de ses inhibiteurs pour se placer dans le cas le plus défavorable, de l’acide acétique et du furfural est alors ajouté pour compenser les pertes. Afin de fermenter ce milieu, une source d’azote y est également ajoutée sous forme de YNB. Il est conseillé par le fournisseur d’en utiliser 6,7 g pour 5 g de sucres fermentescibles, c’est pourquoi une concentration finale en YNB de 134 g/L est visée, puisque l’hydrolysat contient environ 100 g/L d’hexoses. Cette solution est ensuite stérilisée par filtration (filtre de 0,45µm).

L’autre solution utilisée est une solution d’eau distillée stérilisée contenant 100 g/L de glucose et 134 g/L de YNB, Cette solution est de nouveau stérilisée par filtration.

Ainsi, tout mélange de ces deux solutions contient la même quantité de sucres fermentescibles et de YNB. Ceci permet de réduire le stress occasionné aux levures lors d’un passage d’une solution à l’autre pendant l’acclimatation.

Acclimatation

Avant toute chose, les levures sont cultivées pour produire de la biomasse : des colonies sont transférées de la boite de Petri dans 30 mL de YPD, milieu contenant à la fois une source de carbone et une source d’azote. Elles sont laissées plusieurs jours sous agitation à 30°C pour se multiplier.

171 Le contenu est ensuite transféré dans un tube de centrifugation de 10 mL. Les levures sont alors isolées : le tube est centrifugé (5 min à 3000 tr/min) et le surnageant est retiré. Les levures sont ensuite lavées avec de l’eau distillée stérilisée : 8 mL d’eau sont ajoutés, les levures sont mises en suspension puis le tube est de nouveau centrifugé et le surnageant retiré. Trois lavages successifs suivant sont effectués.

Ensuite commence l’adaptation proprement dite. Elle se déroulera en 4 étapes, avec des milieux de fermentation contenant successivement 0%, 25%, 50%, 75% et 100% d’hydrolysat. Deux séries d’essais ont été effectuées.

2.3.1 Première série d’essais

Le premier milieu de fermentation, composé de 4 mL de la solution de glucose et de YNB, est introduit dans un tube à centrifuger, ainsi que 0,4 mL de levures prélevées à la micropipette dans le milieu de culture. Le tube à centrifuger, fermé hermétiquement, est laissé 24h sous agitation dans une étuve à 30°C. Il est ensuite centrifugé et le surnageant est récupéré et congelé pour analyses.

La deuxième étape de l’acclimatation peut débuter. Comme précédemment, 0,4 mL de levures sont prélevés et transférés dans un nouveau tube à centrifuger contenant un milieu de fermentation contenant 25% d’hydrolysat, soit 1 mL de la solution d’hydrolysat et de YNB et 3 mL de la solution de glucose et YNB. Le tube à centrifuger, fermé hermétiquement, est laissé 24h sous agitation dans une étuve à 30°C. Il est ensuite centrifugé et le surnageant est récupéré et congelé pour analyses.

L’opération se répète pour des milieux de fermentation contenant successivement 50% ; 75% et 100% d’hydrolysat.

2.3.2 Deuxième série d’essais

Les résultats de la première série d’essais ne se sont pas révélés concluants. Il est possible que cela soit dû à la faible quantité de levures transférée entre chaque étape. Pour remédier à cela, c’est le milieu de fermentation qui sera transféré, et non les levures.

Après avoir cultivé les levures dans du YPD, celle-ci sont lavées trois fois (voir partie 2.3 ci-dessus). Après le dernier lavage, le tube est centrifugé et le surnageant est retiré. Il ne reste alors plus que les levures dans le tube. L’acclimatation peut commencer. Quatre millilitres de la solution composée de glucose et de YNB sont ajoutés dans le tube de centrifugation (étape à 0% d’hydrolysat). Le tube est placé 24 heures sous agitation dans une étuve régulée à 30°C. Le tube est ensuite centrifugé et le surnageant est récupéré et congelé pour analyses. Les levures sont lavées trois fois à l’eau distillée comme précédemment, avant d’y ajouter 4 mL du milieu de fermentation suivant (25% d’hydrolysat), pour une nouvelle fermentation de 24h.

Ce cycle est répété successivement en ajoutant des milieux contenant 50%, 75% et 100%. Les fermentations contenant 75% et 100% ont été laissées 72h à fermenter, et non 24h.

Des fermentation de contrôle consistant à fermenter des milieux contenant 50%, 75% et 100% d’hydrolysats avec les levures de départ non acclimatées ont été effectuées : des levures cultivées dans du YPD seul (milieu de culture) sont lavées trois fois comme ci-dessus. Après le dernier lavage, le tube est centrifugé et le surnageant est retiré. Le milieu de fermentation voulu est alors ajouté aux levures, puis la fermentation est effectuée pendant 24h à 30°C sous agitation.

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