Chapitre V : Matériels et méthodes
B. Extraction des hémicelluloses
1 Réacteurs utilisés
Deux réacteurs ont été utilisés pour extraire les hémicelluloses Multi-obus ERTAM
Le multi-obus ERTAM a été utilisé pour l’ensemble des extractions des hémicelluloses sur des copeaux effectuées pendant cette thèse.
Il est composé de six obus en acier inoxydable d’une capacité de 3,3 litres chacun placés dans un bain d’huile. Pendant les extractions, le tout est en rotation. Un logiciel permet de réguler le bain d’huile en température. Il permet de paramétrer les durées des montée et descente en températures ainsi que des paliers, dans les limites des possibilités de l’appareil.
Jusqu’à six expériences peuvent être réalisées simultanément. Cependant, dans ce cas, les profils de températures utilisés ne peuvent pas varier.
Mini multi-obus
L’autre réacteur utilisé est constitué d’obus en acier inoxydable de 100 mL de volume. Il est possible de placer 11 obus simultanément dans l’appareil. Un douzième emplacement existe et est occupé par la sonde de température. L’appareil peut être mis en agitation et est régulé en température. Une résistance électrique permet de chauffer l’appareil. La régulation est moins perfectionnée que pour le multi-obus ERTAM. Il est impossible de choisir les gradients de montée et descente en température. Il est seulement possible de déterminer la température finale. L’appareil chauffe alors au maximum jusqu’à atteindre cette température.
165 Cet appareil n’a pas été utilisé pour les extractions car il était impossible de paramétrer la durée de montée en température, mais également à cause du petit volume des réacteurs. En effet, la quantité de copeaux pouvant y être introduite est trop faible pour être représentative, étant donné leur hétérogénéité.
Ces réacteurs se sont toutefois révélés pratiques pour effectuer les hydrolyses secondaires. Le volume des réacteurs se révèle même un avantage, permettant de réaliser des expériences sur de petites quantités. De plus, contrairement au multi-obus ERTAM, il est possible de placer ou prélever des obus pendant l’expérience, et donc d’effectuer des cinétiques.
2 Extractions
Les copeaux utilisés sont décongelés environ 24 heures avant l’extraction. La siccité du lot de copeaux est alors mesurée sur environ 100 g, en les plaçant 24 heures dans une étuve régulée à 105°C.
A partir de cette siccité, la masse de copeaux et de liqueur à introduire dans l’obus est déterminée. La liqueur peut être composée d’eau distillée seule (autohydrolyse), ou contenir un acide ou une liqueur alcaline selon le cas. Les copeaux et la liqueur sont introduits dans l’obus, dont on inerte l’espace de tête en y injectant de l’azote pendant une trentaine de secondes avant de sceller l’obus.
L’extraction se déroule alors suivant le profil de température demandé. Le contenu de l’obus est ensuite filtré. Le volume d’hydrolysat récupéré est mesuré avant d’être mis en bouteille. Celle-ci est placée au réfrigérateur pour un stockage de quelques jours, ou au congélateur pour une conservation plus longue.
En parallèle, les copeaux sont lavés : ils sont placés 24 heures dans un grand volume d’eau dans lequel l’hydrolysat contenu dans les copeaux peut diffuser. L’eau est changée deux fois durant ces 24 heures.
Les paramètres des différentes extractions menées durant cette thèse (cf. chapitre II, partie B) sont résumés dans le Tableau 50. Les NNE sont effectuées avec de la liqueur verte diluée, dont la composition est donnée dans le Tableau 51.
Température (°C) Durée (min)1 H2SO4 (%/bois) L/B
Autohydrolyse 160 160 90-120-30 - 4
Autohydrolyse 170 170 30-65-30 - 2 ; 2,5 ; 3 et 4
Hydrolyse acide 160 90-120-30 H2SO4 (1%) 4
CCE 1 30 0-30-0 NaOH (75%) 4
CCE 2 30 0-240-0 NaOH (75%) 4
CCE 3 30 0-30-0 NaOH (33,3%) 4
Extraction alcaline 90 10-230 NaOH (33,3%) 4
NNE 160 10-110-15 LV2 (3%) 4
Tableau 50 : Paramètres des extractions effectuées ; 1durée de montée en température-durée à température-durée de descente en température 2Liqueur verte diluée
166 Composition NaOH 0,25 g/L Na2S 0,26 g/L Na2CO3 1,92 g/L Na2SO4 0,01 g/L
Tableau 51 : Composition de la liqueur utilisée pour les NNE (liqueur verte diluée)
Rendement d’extraction
Lors de nos extractions, les copeaux n’étaient pas destinés à des usages ultérieurs La mesure de la quantité de matériau extraite pouvait donc être effectuée sur l’ensemble de ces copeaux. Après leur lavage, ceux-ci ne contiennent plus d’hydrolysat. Ils sont placés 24 heures dans une étuve à 105°C, avant d’être pesés. La différence de masse avec les copeaux introduits initialement permet de quantifier la quantité de matière extraite.
3 Hydrolyses secondaires
Hydrolyses acides
Un grand nombre d’hydrolyses secondaires acides ont été effectuées. Les paramètres utilisés pour les essais exploratoires sont résumés dans le Tableau 52, ceux concernant l’optimisation dans le Tableau 53. Pour l’ensemble de ces essais, le mini multi obus a été utilisé.
Pour les essais ne contenant pas d’acide, 25 mL d’hydrolysat y sont introduits. L’espace de tête est ensuite inerté avec de l’azote avant de fermer hermétiquement les obus.
Pour les essais requérant de l’acide sulfurique, 25 mL d’hydrolysat et 1 mL d’un mélange acide sulfurique à 96% (w/w) et d’eau distillée sont introduits dans l’obus La proportion d’acide varie selon la concentration souhaitée. Cela permet d’avoir une même dilution sur l’ensemble des essais. L’espace de tête est ensuite inerté à l’azote, puis l’obus est fermé. Les quantités mesurées dans l’hydrolysat seront ensuite multipliées par le ratio 2625 pour corriger la dilution.
Pour l’unique campagne d’essai nécessitant un temps de montée en température fixé, l’obus a été placé dans l’appareil peu de temps après son démarrage. Il a alors fallu 23 min pour atteindre 160°C.
Pour les autres campagnes d’essais, les obus ont été introduits dans une fois à température. A la fin de chaque hydrolyse, les obus sont plongés directement dans de l’eau froide pour stopper toute réaction. Leur contenu est ensuite placé au réfrigérateur pour un stockage de quelques jours, ou au congélateur pour une conservation plus longue.
Température Durée montée en température Durée à température Concentration H2SO4
120°C 0 min 1 à 6 h 0
160°C 23 min 60 à 210 min 0
190°C 0 min 5 à 40 min 0
160°C 0 min 1 à 4 h 0,5% (w/w)
120°C 0 min 60 min 0 à 6% (w/w)
167
N° essai Durée Température % H2SO4
1 30 min 100°C 0,5% 2 30 min 100°C 4% 3 90 min 100°C 0,5% 4 90 min 100°C 4% 5 30 min 140°C 0,5% 6 30 min 140°C 4% 7 90 min 140°C 0,5% 8 90 min 140°C 4% 9 ; 10 et 11 60 min 120°C 2,25%
Tableau 53 : Paramètres utilisés lors du plan d’expérience concernant l’hydrolyse secondaire
Hydrolyses enzymatiques
Deux solutions commerciales d’enzymes ont été utilisées pour effectuer les hydrolyses enzymatiques : Mannaway (Novozyme) et Celluclast (Sigma Aldrich). Les hydrolyses effectuées avec une seule enzyme ont été menées sur un hydrolysat tamponné au pH optimal pour l’enzyme. Les hydrolysats utilisant deux enzymes en série n’ont pas été tamponnés, afin de pouvoir modifier le pH entre les deux hydrolyses.
3.2.1 Hydrolyses menées avec une seule enzyme
Mannaway est une mannanase utilisée dans l’industrie de la pâte cellulosique. Elle est appliquée à raison de 0,1 à 0,5 kg de solution par tonne de biomasse. Pour ces essais exploratoires, les enzymes ont été surdosées pour atteindre 35 kg par tonne de biomasse (soit 35 mg par g). La biomasse prise en compte ici est l’ensemble des oligomères solubilisés dans l’hydrolysat. Le pH de l’hydrolysat est tout d’abord corrigé à 8,0, pH optimal de la Mannaway, en utilisant une solution de soude (1 mol/L), puis tamponné en utilisant une solution composée de K2HPO4 (0,079 mol/L) et KH2PO4 (0,0045 mol/L) : 0,5 mL de tampon sont ajoutés à 5 mL d’hydrolysat à pH 8, ainsi que 0,5 mL d’une solution de Mannaway afin d’obtenir 35 mg de solution par gramme d’oligomères.
L’hydrolyse est effectuée pendant 48 heures à 50°C, avec des prélèvements après 4h et 24h d’hydrolyse.
La Celluclast est une solution comprenant plusieurs enzymes dont l’activité est supérieure ou égale à 700 U/g. Le pH de l’hydrolysat est corrigé à 5,5, pH optimal de la Celluclast, avec une solution de soude (1 mol/L) puis tamponné en utilisant une solution composée de K2HPO4 (0,045 mol/L) et de citrate (0,0018 mol/L) : 0,5 mL de ce tampon sont ajoutés à 5 mL d’hydrolysat, ainsi que 0,5 mL d’une solution de Celluclast afin d’obtenir une activité de 30 U/g d’oligomères.
L’hydrolyse est effectuée pendant 48 heures à 50°C, avec des prélèvements après 4h et 24h d’hydrolyse.
3.2.2 Hydrolyses menées avec les deux enzymes
Des hydrolyses ont été menées avec les deux enzymes successivement. Le pH de l’hydrolysat est tout d’abord été corrigé avec une solution de soude (1 mol/L) pour atteindre le pH optimal de la première enzyme. Celle-ci est ajoutée puis l’hydrolyse menée à la température optimale
168
correspondante. Après 24h, le pH est de nouveau corrigé avec la solution de soude ou une solution de citrate (20 g/L) avant d’ajouter la seconde enzyme et laisser de nouveau 24h à la température optimale de cette seconde enzyme. Des prélèvements sont effectués après 4h, 24h, 28h et 48h. Les quantités d’enzymes par rapport aux oligomères sont identiques à celles utilisées lors des hydrolyses précédentes.
Une hydrolyse a également été effectuée avec les deux enzymes simultanément. Le pH de l’hydrolysat est fixé à 6,5 avec une solution de soude (1 mol/L) puis tamponné avec une solution de K2HPO4 (0,011 mol/L) et KH2PO4 (0,029 mol/L). Les enzymes sont ajoutées pour atteindre les mêmes quantités que précédemment par rapport à la concentration en oligomères. L’hydrolyse est menée pendant 72 heures à 50°C, avec des prélèvements après 4h, 24h et 48h.
4 Calcul des teneurs en hexoses et pentoses extraits
Les résultats d’hexoses et pentoses extraits lors des procédés d’extraction sont calculés à partir des concentrations en saccharides présents dans les hydrolysats, mais également à partir des concentrations en HMF, furfural, acide formique et acide lévulinique.
Il est considéré qu’une mole d’hexose se dégrade en une mole de HMF, elle-même donnant une mole d’acide lévulinique et une mole d’acide formique (voir les mécanismes de formation [3], [185]).
De même, il est considéré qu’une mole de pentose se dégrade en une mole de furfural, elle-même donnant une mole d’acide formique [3].
Les deux types de saccharide peuvent donc former de l’acide formique. Il est alors considéré que la quantité d’acide formique à attribuer aux hexoses est la même que celle d’acide lévulinique (en moles), le reste provenant de la dégradation du furfural.
Le calcul des quantités extraites s’effectuant sur l’ensemble des saccharides (monomères et oligomères), ce sont les concentrations en saccharides et en produits de dégradation mesurées après les hydrolyses secondaires qui sont utilisées dans ces calculs.
Ainsi, les Equations 21 et 22 ont été utilisées pour calculer les concentrations en hexoses et pentoses extraits. Elles ont été déterminées grâce aux masses molaires des différents composés, rappelées dans le Tableau 54.
Les saccharides extraits sont encore sous-évalués avec cette méthode, étant donné qu’il existe d’autres produits de dégradation, et que le furfural et le HMF peuvent polymériser entre eux [3]. Or ces polymères ne sont pas comptabilisés.
Equation 21
CC6 extraits = CC6+180,2
126,1CHMF+ 180,2
116,1CAcide lévulinique
169 Equation 22 CC5 extrais = CC5+150,1 96,1 Cfurfural+ 150,1 46 (CAcide formique− 46 116,1CAcide lévulinque)
Concentrations en g/L dans les hydrolysats
Masse molaire (g/mol)
Hexoses 180,2 Pentoses 150,1 HMF 126,1 Furfural 96,1 Acide Formique 46,0 Acide Lévulinique 116,1
Tableau 54 : Masses molaires des hexoses, pentoses, et produits de dégradation
5 Evaporation de l’hydrolysat
Certains hydrolysats ont été concentrés par évaporation en vue de les fermenter. Ces évaporations ont été effectuées à 70°C sous une pression de 35 kPa dans un rotavapeur jusqu’à évaporation du volume voulu.