Les ferlines

Les ferlines sont des protéines exprimées par l’ensemble des eucaryotes, aussi bien dans les organismes les plus simples comme le nématode (Caenorhabditis elegans) que dans les organismes les plus complexes tels que les mammifères. Le premier membre de la famille des ferline (Fer-1) a été identifié chez le nématode en étudiant la dépendance au Ca²⁺ du processus de spermatogénèse (Achanzar and Ward, 1997). Les protéines appartenant à cette famille sont caractérisées par la présence d’un domaine transmembranaire permettant leur insertion dans les membranes lipidiques.

Syt fixant le Ca²⁺ Syt ne fixant pas le Ca²⁺

42 Les études portant sur les rôles des ferlines, par l’introduction de mutations, ont permis de mettre en évidence leur implication dans la fusion vésiculaire dépendante du Ca²⁺, le trafic membranaire et la réparation de la membrane plasmique (Achanzar and Ward, 1997; Washington and Ward, 2006; Krajacic et al, 2009; Bansal et al., 2003; Lek et al., 2013; Redpath et al., 2014). Les ferlines se distinguent en deux grandes familles en fonction de la présence ou l’absence du domaine DYSF (Lek et al., 2010). Ce dernier est un domaine riche en résidus aromatiques dont le rôle n’a pas encore été clairement identifié. Cependant, il pourrait jouer le rôle de signal de localisation nucléaire (Therrien et al., 2006). Chez l’Homme, il existe six protéines identifiées comme appartenant à cette famille (Fig. 23B):

- La dysferline (FER1L1) impliquée dans la réparation membranaire dépendante du Ca²⁺ des cellules musculaires.

- L’otoferline (FER1L2) impliquée dans l’exocytose dans cellules ciliées auditives et vestibulaires.

- La myoferline (FER1L3) impliquée dans la formation des myofibres pendant leur développement.

- FER1L4, FER1L5 et FER1L6 dont l’expression tissulaire et le rôle ne sont pas encore connus.

A

B

Figure 23: Les synaptotagmines et les ferlines

(A) En haut, une représentation simplifiée de la synaptotagmine avec ses domaines C₂A et C2B. En bas, l’organisation moléculaire des domaines C2A et C2B montrant les résidus aspartates (D) et sérines (S) impliqués dans la fixation du Ca²⁺ intracellulaire (Adaptée depuis Südhof, 2002). (B) Les six protéines de la famille des ferlines (FER1) exprimées par les mammifères, comprenant le senseur calcique présumé des cellules ciliées : l’otoferline (FER1L2). TM: Segment transmembranaire. Le domaine DYSF serait un signal de localisation nucléaire.

43 10.3 Les senseurs calciques des cellules sensorielles

a. Les photorécepteurs et les cellules bipolaires

De nombreuses études suggèrent que le senseur calcique impliqué dans l’exocytose des cellules sensorielles de la rétine des mammifères serait Syt I (Bernston and Morgans, 2003; Mercer and Thoreson, 2011). Syt II semble être absente des synapses à ruban des photorécepteurs et des cellules bipolaires chez les vertébrés (Fox and Sanes, 2007). Cependant, aucune étude à ce jour ne s’est encore intéressée à l’exocytose dépendante de ces deux senseurs calciques, notamment dans des modèles animaux mutés pour Syt I et/ou Syt II, dans le but de confirmer le rôle de ces deux protéines dans la régulation de l’exocytose des cellules sensorielles de la rétine.

b. L’otoferline: le senseur calcique des cellules ciliées ?

Contrairement aux synapses centrales, les cellules ciliées matures auditives et vestibulaires n’expriment pas et n’utilisent pas les synaptotagmines comme senseur calcique (Safieddine and Wenthold, 1999; Beurg et al., 2010; Safieddine et al., 2012).

Des études du génome de quatre familles libanaises atteintes de surdité profonde ont mis en évidence la présence d’une mutation non-sens sur le gène codant pour la protéine otoferline (Yasunaga et al., 1999; Yasunaga et al., 2000). Les mutations touchant le gène de l’otoferline sont à l’origine de la surdité autosomique récessive DFNB9. Cette protéine exprime l’ensemble des domaines caractéristiques de la famille des ferlines à l’exception de leur domaine Dysf (Fig. 23B). Chez l’Homme, deux isoformes de l’otoferline ont été identifiées. On distingue ainsi l’isoforme courte d’environ 1230 acides aminés à trois domaines C₂ et l’isoforme longue de 1997 acides aminés à six domaines C₂ (Yasunaga et al., 2000; Roux et al., 2006). Mais il apparaît que seules les mutations touchant l’isoforme longue sont à l’origine de la surdité DFNB9. Chez la souris, seule l’isoforme longue a été trouvée (Yasunaga et al., 2000).

Pour comprendre le rôle de l'otoferline dans le système auditif et vestibulaire, l’équipe de Christine Petit à l’Institut Pasteur à Paris a généré un modèle murin avec le gène OTOF inactivé (Roux et al., 2006). Ces souris présentent une surdité profonde et les études électrophysiologiques associées à l’imagerie confocale et électronique ont révélé que l’exocytose des CCIs et des cellules ciliées utriculaires est fortement diminuée et ralentie. Cependant l’otoferline ne semble pas être impliquée dans la mise en place et le maintien des zones actives des CCIs (Roux et al., 2006 ; Beurg et al., 2010 ; Wang et al., 2014) et des cellules ciliées utriculaires (Dulon et al., 2009). Par la suite, de nombreuses études ont permis de mieux comprendre le rôle de l’otoferline dans la tramission synaptique des cellules ciliées sensorielles. Notre équipe a montré que, chez la souris, l’exocytose dépendante de l’otoferline se met en place à partir du septième jour après la naissance (P7). Avant cet âge, l’exocytose apparaît dépendante des senseurs calciques Syt I et Syt II (Beurg et al., 2010; voir revue: Safieddine et al., 2012).

Une équipe anglaise a aussi mis en évidence le rôle de la synaptotagmine IV dans la linéarisation de la dépendance au Ca²⁺ de l’exocytose (Johnson et al., 2010). Il a aussi été montré que cette linéarisation dépendrait de l’expression correcte du canal potassique SK2 dans la membrane des CCIs pendant la maturation de l’organe auditif (Johnson et al, 2007; Johnson et al., 2013). Néanmoins, les mécanismes moléculaires à l’origine de cette linéarisation sont encore mal compris.

44 La présence de six domaines C2, dont cinq présentant des sites capables de fixer les ions Ca²⁺, suggère que l’otoferline est une protéine capable d'interagir avec les phospholipides membranaires et de produire de grandes modifications conformationnelles Ca²⁺-dépendantes. L’étude de la fusion membranaire par la reconstitution de liposome in vitro, montre que l’otoferline accélère la fusion vésiculaire dépendante du Ca2+

et que son domaine C₂A ne fixe pas le Ca²⁺ (Johnson and Chapman, 2010). L’affinité calcique de l’otoferline a été mesurée entre 13 et 25 µM. L'otoferline serait donc vingt fois plus sensible aux variations de Ca²⁺ intracellulaire que Syt I et Syt I.

Question 3: Quelle est l’affinité calcique réelle de l’otoferline, in vivo, dans les cellules