DUX4 : un facteur de transcription nécessaire dans les gonades mais toxique dans le muscle ? toxique dans le muscle ?

Afin de déterminer la fonction d’une protéine, l’analyse de gènes homologues chez d’autres espèces peut fournir des informations sur sa fonction chez l’Homme. Des analyses phylogéniques des répétitions D4Z4 ont mis en évidence la présence de paralogues chez les primates (Chimpanzee, orangutan), des mammifères africains (familles des Eléphants) ainsi que chez les rongeurs, où l’ORF DUX4 est conservé depuis environ 100 millions d’années, suggérant un rôle ancestral de DUX4 (Clapp et al., 2007). Chez la souris, Duxbl, paralogue de DUX4, est spécifiquement exprimé durant le développement des gonades, dans les oocytes, les spermatogonies et durant les phases précoces de développement du muscle squelettique (Wu et al., 2010) suggérant que Duxbl joue un rôle majeur durant la myogenèse et la reproduction. Compte tenu du rôle de Duxbl, une équipe s’est intéressée, chez l’Homme, à l’expression de DUX4 dans des testicules d’individus contrôles (Snider et al., 2010). Il a ainsi été mis en évidence, par PCR et immuno-histochimie, que DUX4-FL était présent en dehors d’un génotype pathologique. De plus, il a été montré que la sur-expression de DUX4 induisait des dérégulations géniques majeures, notamment l’expression de gènes ayant un rôle dans la lignée germinale (Geng et al., 2012). Ces résultats suggèrent donc que DUX4 pourrait avoir un rôle normal dans les gonades. Chez les individus FSHD, l’absence de répression somatique de DUX4 dans le muscle squelettique, serait à l’origine d’un gain de fonction toxique médié par l’activation d’un programme gamétogénique non compatible avec le tissu (Geng et al., 2012).

Il faut cependant noter que les isoformes produites dans les gonades ne sont pas similaires à celles observées dans le muscle (Snider et al., 2010). DUX4 est constitué de deux exons contenus dans chaque répétition D4Z4 mais la dernière répétition possède une région 3’UTR renfermant 5 exons supplémentaires (exon 3 à 7) présents uniquement sur l’haplotype 4qA. Une étude a montré que dans les gonades, l’exon 3 contenant le signal de poly(A) est épissé pour rejoindre les exons 4 à 7 contenant un second signal de poly(A) localisé dans

105 l’exon 7 (Snider et al., 2010). De plus, ces transcrits sont issus à la fois du chromosome 4 et du chromosome 10 (Snider et al., 2010), tandis que dans le muscle squelettique de patients FSHD et Contrôles, seul le chromosome 4 serait à même de produire des transcrits DUX4. Il semble donc qu’il existe un mécanisme tissu spécifique bloquant la transcription à partir du chromosome 10 dans le muscle squelettique. Puisque le statut épigénétique de la région semble influer sur les isoformes de DUX4, il est possible d’envisager qu’une hypométhylation des répétitions D4Z4 du chromosome 10 provoque une dé-repression transcriptionnelle de DUX4 dans les testicules. Si cette hypothèse est valide, alors chez les individus FSHD 2, où les répétitions D4Z4 sont hypométhylés à la fois sur les chromosomes 4 et 10 (chez les individus FSHD 1 l’hypométhylation n’est retrouvé que sur le chromosome 4), DUX4 pourrait être produit à partir de ces deux chromosomes.

La variation de l’épissage dans la région 3’UTR n’influençant pas la séquence protéique, nous ne pouvons que spéculer sur sa fonction. Il est possible que la présence d’une région 3’UTR agrandie assure une meilleure stabilité du transcrit ou permette de bloquer les fonctions toxiques de DUX4 grâce à des interactions ARN-Protéine spécifiquement dans les gonades. Pour tester l‘hypothèse de la stabilité, il est possible de générer des constructions où la région génomique (exon 1 à 7) a été clonée et où des mutations des sites donneurs et accepteurs d’épissages ont été introduites. L’établissement de lignées cellulaires exprimant stablement ces constructions peuvent ensuite être traité avec un agent bloquant la transcription (Actinomycin D) afin de déterminer la demie vie de l’ARN d’intérêt (quantification par PCR en temps réel).

Il est néanmoins important de souligner qu’à ce jour, aucune étude n’a été publiée confirmant ou infirmant la présence d’isoformes de DUX4 différentes dans les testicules.

2.5 DUX4, un gène, plusieurs protéines ?

L’analyse de la séquence génomique a mis en évidence la présence de trois codons initiateurs pouvant donc permettre la traduction de trois protéines (Figure 39). La sur-expression de DUX4 a permis de confirmer par western blot, la production de protéines issues des codons MKG et MQG. Puisque l’anticorps utilisé ne peut détecter la protéine provenant du troisième codon MQG (épitope absent), il n’est pas certain qu’une protéine soit produite à partir de ce codon (Snider et al., 2009, 2010). Il est important de noter que ces résultats ont été obtenus dans des essais de sur-expression, or à l’heure actuelle, il n’existe aucune donnée sur

106 les formes endogènes de DUX4, dans le muscle squelettique. Les seules détections de DUX4 endogènes ont été réalisées sur des extraits protéiques de testicules (Snider et al., 2010), ou, par western blot, seule une isoforme a été mise en évidence, de plus, la taille détectée n’apparait pas similaire à celle observée en sur-expression. Plusieurs hypothèses sont susceptibles d’expliquer ces résultats. Tout d’abord, puisqu’il n’existe aucune donnée in vivo sur les formes de DUX4 produites dans le muscle squelettique pathologique, il n’est pas possible de déterminer qu’elle forme est produite. Il est également important de rappeler que dans les testicules, les transcrits DUX4 semblent provenir à la fois du chromosome 4 et du chromosome 10 (Snider et al., 2010), par conséquence, il est impossible de savoir qu’elle est l’origine de la protéine dans les testicules.

Ces résultats suggèrent donc que plusieurs protéines peuvent être produites à partir de start alternatif, mais ces isoformes protéiques n’ont à ce jour jamais été identifiées dans des conditions d’expression endogène.

Figure 39 : Start alternatif et codon initiateur dans l’ORF de DUX4 pouvant générer plusieurs isoformes de DUX4 visibles par sur-expression en western blot.

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