2.1 Transcription des miARN
Les miARN peuvent être issus soit de régions intergéniques, souvent regroupés en cluster (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee et al., 2002; Mourelatos et al., 2002), et donc sous la dépendance de leur propre promoteur ou alors être d’origine intragénique et donc dépendant de l’expression d’un transcrit donné (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001; Lee et al., 2004). Chez l’Homme, 50 à 80% des miARN sont localisés dans des régions introniques de gènes codants, la majorité dans la portion centrale de l’intron (Rodriguez et al., 2004; Kim and Kim, 2007; Morlando et al., 2008).
Les miARN sont transcrits sous forme d’un long ARN appelé pri-miARN pouvant contenir plusieurs pré-miARN (intergénique), ou être inclus dans un transcrit codant (intragénique) (Figure 27). Ce transcrit primaire possède une cape en 5’ ainsi qu’une queue poly(A) en 3’, démontrant que celui-ci est produit à partir d’une ARN polymérase de type 2 (Tam, 2001; Aukerman and Sakai, 2003).
Figure 27 : Localisation et transcription des miARN intergéniques et intragéniques :
Les miARN intergénique sont regroupés sous forme de cluster et leur transcription est dépendante de leur propre promoteur
Les miARN intragéniques sont eux majoritairement localisés dans les 3’UTR de gènes, leur transcription est donc dépendante du gène hôte.
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2.2 Clivage par la machinerie DROSHA-DGCR8 et export
Un seul pri-miARN peut contenir jusqu’à 6 miARN précurseurs, possédant une structure secondaire dite en « épingle à cheveux » appelés pre-miARN. Le pri-miARN est reconnu et clivé par le complexe « microprocesseur » constitué d’une protéine de liaison à l’ARN double brin (DGCR8) et d’une enzyme RNAse de type 3 (DROSHA) (Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004; Landthaler et al., 2004; Lee et al., 2003). DGCR8 est le premier acteur dans le clivage du pri-miARN car il guide DROSHA sur la structure en « épingle à cheveux ». DGCR8 se fixe sur la portion double brin située à la jonction entre le simple brin du pri-miARN et la structure en épingle à cheveux de celui-ci. DROSHA peut alors s’associer à DGCR8 et venir cliver l’ARN à environ 11 paires de bases de la jonction (Han et al., 2006) (Figure 28). Le produit ainsi généré fait environ 60 à 70 nucléotides et est appelé pré-miARN. Il conserve sa structure en tige boucle et est constitué d’une extrémité 5’phosphate et d’une extrémité 3’ hydroxyl avec 2 nucléotides sortants permettant sa maturation ultérieure.
Figure 28: Maturation dès pri-miARN en pré-miARN par le complexe micropocesseur : DGCR8 fixe la structure ARN double brin permettant ainsi la fixation de DROSHA qui clive
88 la structure tige boucle de l’ARN hôte liberant ainsi le pré-miARN possédant une extrémité 5’P rentrante nécessaire à son export vers le cytoplasme.
Le pré-miARN est ensuite exporté du noyau vers le cytoplasme à l’aide d’une protéine cargo appartenant à la famille des karyophérines : l’exportin 5 associée à la protéine Ran-GTP (Ras-related nuclear protein fixant le GTP) indispensable à l’export nucléaire. Il semble que cette protéine soit majoritairement utilisée pour le transport des pré-miARN (Yi et al., 2003; Gwizdek et al., 2004). La reconnaissance du pré-miARN par l’exportin 5 n’est pas séquence dépendante, en effet, il a été montré que l’association passe par une reconnaissance de la structure ARN double brin, composant la tige du pré-miARN, de manières Ran-GTP dépendante (Bohnsack et al., 2004; Zeng and Cullen, 2004). Enfin l’extrémité 3’ sortant du miARN est indispensable à un export efficace car ele favorise la reconnaissance du pré-miARN par l’exportin 5.
2.3 Maturation cytoplasmique médiée par DICER
Une fois exporté dans le cytoplasme, le pré-miARN subit une nouvelle étape de maturation médiée par une RNAse cytoplasmique de type 3 appelée DICER, générant un duplexe micro ARN de 19 à 23 nucléotides. DICER, comme les autres RNAse III, clive en laissant deux nucléotides libres à l’extrémité 3’ de son substrat servant à la sélection de l’un des 2 brins. En effet, en fonction de la stabilité thermodynamique duplex (Khvorova et al., 2003; Krol et al., 2004; Schwarz et al., 2003), l’un des 2 brins est sélectionné (brin guide) et chargé dans le complexe micro ARN-RISC (miRISC : micro ARN induced silencing complexe) tandis que le second est dégradé (brin star). Néanmoins, il arrive que le brin star soit assez stable pour être chargé dans le miRISC et jouer le rôle de miRNA (Okamura et al., 2008).
Le complexe RISC est composé d’une molécule de miARN, d’une protéine de type Argonaute (AGO) et d’une protéine de type GW182. Les protéines Argonautes possèdent quatre domaines distincts : les domaines N-terminal, Paz, Mid et PIWI. Chez les mammifères, il existe 4 protéines AGO, AGO1 à AGO4, mais seul le domaine PIWI de AGO2 possède une activité enzymatique de type RNase-H like. Le complexe miRISC identifie l’ARNm par complémentarité avec le miARN et conduit soit au clivage du transcrit (complémentarité
89 miARN/mARN cible parfaite) soit à l’inhibition de la traduction de l’ARNm cible (complémentarité imparfaite) (Bartel, 2004; Lim et al., 2005).
Ainsi, chez l’Homme, les micros ARN sont capables de cibler un ARNm de façon séquence-spécifique. Une complémentarité parfaite n’est pas nécessaire à l’activité du miARN. En effet, seule la région allant du 2ème aux 8ème nucléotides (cotés 5’) nécessite un appariement parfait. Cette région, appelée séquence « seed », est donc critique pour la reconnaissance de la cible et une mutation de l’un de ces nucléotides diminue significativement l’efficacité d’action du miRNA. La région 3’ dont l’appariement n’est pas indispensable permet néanmoins de stabiliser le duplex miARN-ARNcible. La taille de la région « seed » étant réduite (7 nucléotides) plusieurs microARN peuvent cibler des centaines d’ARNm différents et un même ARN peut être la cible de plusieurs miARN permettant une régulation négative efficace par effets additifs (Bartel, 2004).