B.2. Le facteur d’échange Epac

En 1998, une nouvelle famille de protéines activées par l’AMPc, nommé Epac (exchange protein directly activated by cAMP) a été découverte (Kawasaki et al., 1998; de Rooij et al., 1998). Ces protéines contiennent un domaine de liaison pour l’AMPc (CBD : cAMP binding domain) qui est homologue à celui des sous-unités régulatrices de la PKA. L’AMPc se lie à la protéine Epac avec une haute affinité et active la famille Ras des petites GTPases, Rap1 et Rap2, ce qui entraîne l’échange du GDP en GTP sur ces petites protéines G, permettant ainsi leur interaction avec les effecteurs spécifiques (Figure 18). Rap1 peut être activé en réponse à une série de seconds messagers dont l'AMPc (de Rooij et al., 2000), et peut également être phosphorylé par la PKA sur son extrémité C-terminale, mais cette phosphorylation n'est pas nécessaire pour son activation dépendante de l'AMPc (de Rooij et

al., 1998). Il existe deux isoformes d’Epac, Epac1 et Epac2, produits de gènes indépendants

chez les mammifères. Alors qu’Epac1 est exprimé de manière ubiquitaire dans tous les tissus, Epac2 est plus limité dans sa distribution tissulaire (Kawasaki et al., 1998; de Rooij et al., 1998). Epac-1 a notamment été détectée dans les CML fraîchement dissociées d’aorte et d’artère mésentérique de rat (Purves et al., 2009) et les cellules endothéliales HUVEC (Kooistra et al., 2005). Ces deux isoformes présentent une importante homologie de séquence et contiennent toutes deux une région N-terminale régulatrice comprenant un domaine d’adressage intracellulaire (DEP : Dishevelled, Egl-10, Pleckstrin) et les domaines de liaison pour l’AMPc (CBD), et une région C-terminale catalytique. La région catalytique d’Epac1 se compose d'un motif d’échange RAS (REM), un domaine d’association RAS (RA) et du domaine classique d’homologie CDC25 (CDC25HD) responsable de l'activité d'échange des nucléotides (Figure 18).

La découverte de la protéine Epac comme une nouvelle cible intracellulaire de l’AMPc suggère que le mécanisme de signalisation de l'AMPc est beaucoup plus complexe que ce que

l'on croyait auparavant. Ainsi, une grande partie des effets médiés par l'AMPc qui était attribués à la seule action de la PKA peut aussi être transduite par Epac. A ce jour, de vastes études ont démontré que la protéine Epac est impliquée dans une multitude de fonctions cellulaires liées à l'AMPc telles que l’adhésion cellulaire (Rangarajan et al., 2003; Enserink et

al., 2004), les jonctions cellule-cellule (Kooistra et al., 2005; Cullere et al., 2005), l'exocytose

et la sécrétion (Ozaki et al., 2000), la différenciation cellulaire (Kiermayer et al., 2005) et la prolifération et l'hypertrophie cardiaques (Morel et al., 2005; Métrich et al., 2008).

AC

AMPc

Epac

Région régulatrice Région catalytique Région régulatrice Région catalytique

A

B

CBD CBD-B CBD-A

Figure 18 : Représentation schématique de la structure et de l’activation des protéines Epac.

A: Structure des protéines Epac (Modifié de (Gloerich & Bos, 2010)). DEP: Dishevelled, Egl-10 and Pleckstrin, CBD: cAMP binding domain, REM: RAS exchange motif, RA: RAS association domain, CDC25HD: CDC25-homology domain. B: Mécanisme d’activation de la protéine Epac.

  75 Au niveau vasculaire, le rôle de la protéine Epac a été initialement recherché dans la cellule endothéliale. La signalisation de Rap par Epac1, la principale isoforme d’Epac exprimée dans les cellules endothéliales (Kooistra et al., 2005; Sehrawat et al., 2008), contribue aux effets de l'AMPc sur la fonction endothéliale. Ainsi, la stimulation d’Epac par une approche pharmacologique (analogue de l’AMPc sélectif d’Epac, 007 : 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP) diminue la perméabilité des HUVEC en culture d'une manière dépendante d’Epac1 et de Rap (Kooistra et al., 2005). De même, la perméabilité accrue induite par des médiateurs inflammatoires tels que la thrombine est contrecarrée par l’activation d’Epac1 (Cullere et al., 2005). Parallèlement, l'activation d’Epac provoque l'accumulation de protéines jonctionnelles au niveau des contacts cellule-cellule et l'augmentation de l'adhésion cellulaire via les VE-cadhérines (Fukuhara et al., 2005; Kooistra et al., 2005). Le rôle d’Epac1 dans la régulation de la perméabilité vasculaire a été confirmé in vivo, dans des vaisseaux sanguins murins : l'administration de 007 inhibe la perméabilité induite par le facteur de croissance endothélial (VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor) ou par le facteur d’activation plaquettaire (Fukuhara et al., 2005; Adamson et al., 2008). Récemment, l’équipe de Maurice a montré que dans une lignée de cellules endothéliales artérielles humaines, la PDE4D interagit directement avec Epac1 afin de stabiliser le complexe Epac1-VE-cadhérine, ce qui est essentiel à la régulation de la perméabilité vasculaire (Rampersad et al., 2010). Ils ont également mis en évidence, dans les mêmes cellules, l’existence d’un complexe comprenant à la fois PDE3B, Epac1 et la sous-unité régulatrice p84 de la kinase PI3Kγ (phosphatidyl inositol 3 kinase γ). Ce signalosome permet l'intégration des signaux régulés par l’AMPc, Epac1 et la PI3Kγ, contrôlant ainsi plusieurs fonctions importantes des cellules endothéliales comme l'angiogenèse (Wilson et al., 2011).

Dans les CMLV en culture, contrairement à la PKA, l’activation d’Epac favorise le processus de migration, et l’expression d’Epac1 est augmentée dans les CMLV de l'artère fémorale de souris suite à une blessure mécanique in vivo, tandis que celle de la PKA est diminuée. Ces résultats suggèrent qu’Epac1 peut jouer un rôle important lors du remodelage vasculaire et de la resténose après une lésion vasculaire en contribuant à la formation d’une néo-intima (Yokoyama et al., 2008).

Concernant le rôle d’Epac dans le contrôle du tonus vasculaire, des travaux ont mis en évidence une association d’Epac1 avec la sous-unité régulatrice SUR2B (sulfonylurea receptor 2B) du canal KATP. Dans des CMLV isolées d’aorte de rat, l’activation d’Epac bloque l'activité du canal KATP via un mécanisme dépendant du Ca2+ impliquant l'activation de

la protéine phosphatase 2B sensible au Ca²⁺, la calcineurine (Purves et al., 2009). Du fait de l’implication de ce canal potassique dans le maintien du potentiel de membrane des CML, son inhibition suite à l’activation d’Epac1 pourrait entrainer une augmentation du tonus vasculaire. Des études fonctionnelles suggèrent, à l’inverse, un effet relaxant de l’analogue de l’AMPc sélectif d’Epac. En effet, deux études ont montré que le 007 induit une relaxation de la veine porte de lapin et de la trachée humaine en modulant la balance d’activation Rho-A/Rac1 en faveur de Rac1, levant ainsi l’inhibition de la MLCP (Roscioni et al., 2011; Zieba

et al., 2011). En l’absence d’inhibiteur sélectif de la protéine Epac, il est à l’heure actuelle

difficile d’évaluer le rôle fonctionnel de cette protéine dans la réponse relaxante β-adrénergique.