Extraction sur phase solide

L’extraction sur phase solide (Solid Phase Extraction, SPE)130 se base sur les mêmes principes que la LLE, à l’exception que le solvant d’extraction est substitué par une phase solide et que l’état d’équilibre n’est jamais atteint.131,132 Le procédé se déroule en plusieurs étapes séquentielles (Schéma 6) :

 le conditionnement de la cartouche contenant la phase solide,

 la rétention de l’échantillon,

 le rinçage permettant l’élimination des impuretés,

 l’élution de l’analyte étudié.

Matrice d’échantillon = analyte = contaminants Ajout du solvant d’extraction (jaune) non miscible

Agitation _{Repos du mélange et} récupération de la

phase contenant l’analyte

Schéma 6. Principe de l’extraction sur phase solide.

Conditionnement

Le conditionnement consiste à passer un solvant à travers la phase solide contenue dans la cartouche de façon à remplir ce milieu poreux de liquide. Cette étape est nécessaire afin d’assurer l’homogénéité de l’environnement dans lequel l’échantillon est déposé. La présence de bulles d’air ou un mouillage incomplet peut aboutir à une rétention et une élution faussées lors de la procédure.

Dépôt de l’échantillon

La matrice liquide contenant l’analyte d’intérêt ainsi que les contaminants indésirables est chargée dans la cartouche. L’analyte ainsi que la plupart des impuretés sont retenus dans la phase solide sur la surface ou par la pénétration de la couche externe des molécules de cette surface. Il se créé alors un équilibre de distribution (de la même manière que pour la LLE), caractérisé par un coefficient Kd qui indique quelle fraction de l’analyte est restée en solution, et quelle fraction a été adsorbée par ou a pénétré la phase solide. Par souci de praticité, Kd est couramment exprimé en fonction des concentrations selon la formule :

Conditionnement de la

phase solide ( ) ^{Chargement de l’échantillon} = analyte = contaminants

𝐾_𝑑 =^{[𝑎𝑛𝑎𝑙𝑦𝑡𝑒]𝑝ℎ𝑎𝑠𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑖𝑑𝑒} [𝑎𝑛𝑎𝑙𝑦𝑡𝑒]_{é𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛}

Ainsi, lorsque l’échantillon est en quasi-totalité retenu par la phase solide, le coefficient de partition est très élevé. La SPE en phase inverse implique une matrice d’échantillons polaire (généralement aqueuse) ou modérément polaire et une phase stationnaire apolaire (dans le cas de ces travaux, une phase C18). La rétention dans la cartouche des composés organiques en solution polaire est principalement due aux forces attractives entre les liaisons carbone-hydrogène de l’analyte et les groupes fonctionnels de la surface de la phase solide. Ces interactions apolaire-apolaire sont communément appelées forces de van der Waals, forces de dispersion, ou effet hydrophobe. Les composés polaires présents dans l’échantillon ne sont pas retenus lors du chargement de l’échantillon et éluent avec la matrice (composé noir dans le Schéma 6).

Lavage

Pendant la phase de rétention, de nombreux composés présents dans la matrice complexe d’échantillons ont été retenus par la phase solide (composé orange Schéma 6) au même titre que l’analyte d’intérêt (composé rouge Schéma 6). Une élution effectuée directement après le passage de l’échantillon dans la cartouche pourrait alors conduire à la co-élution de contaminants et impuretés avec le composé étudié. Ainsi, afin de minimiser les interférences que cette pollution indésirable serait susceptible de créer lors de l’analyse suivant l’extraction, un ou plusieurs rinçages sont effectués entre le chargement de l’échantillon sur la phase solide et l’élution. Chaque étape de rinçage implique un solvant soigneusement choisi de façon à mettre en place un équilibre dans lequel le coefficient de partition est élevé pour l’analyte ciblé (il reste alors dans la phase solide) et faible pour les impuretés qui sont de ce fait éluées avec le solvant. Des expériences d’efficacité d’extraction permettent de déterminer les solvants optimaux pour cette opération. Au terme de ces lavages, il ne reste idéalement dans la phase solide que le composé que l’on souhaite analyser.

Elution

La dernière étape de la SPE consiste à éluer l’analyte de la phase solide et le collecter pour qu’il se trouve dans un milieu permettant son analyse. Lorsqu’un liquide fournit un environnement plus favorable pour l’analyte que la phase solide, le composé d’intérêt est élué par le solvant qui est alors recueilli à la sortie de la cartouche : c’est l’étape d’élution. Dans ce

cas, le solvant est choisi afin d’obtenir un Kd très faible, c’est-à-dire que l’échantillon a une préférence largement plus marquée pour le solvant que pour la phase stationnaire. La SPE apporte un avantage intéressant par rapport à la LLE ; en effet le solvant d’élution utilisé a la possibilité d’être miscible avec l’échantillon de départ car ces deux liquides ne sont jamais en contact direct du fait de la séquentialité du procédé. Ainsi, il est possible d’éluer un échantillon aqueux avec du méthanol (miscible dans l’eau), une combinaison qui ne serait pas possible à mettre en place dans une LLE.

La SPE est une technique de préparation d’échantillons couramment utilisée pour son efficacité, sa simplicité et sa possibilité d’automatisation.133,134 Elle offre également un éventail d’avantages analytiques :

 Concentration de l’échantillon : il suffit d’utiliser un volume faible de solvant d’élution afin d’obtenir une solution concentrée de l’analyte. Une solution alternative est de choisir un solvant organique volatile lors de l’élution, permettant une concentration facile à la suite de la SPE.

 Lavage : la rétention sélective de l’analyte après les étapes de rinçage permet de diminuer le nombre et la quantité de contaminants au sein de l’échantillon. Ainsi les analyses peuvent être conduites sur un liquide plus propre où l’analyte pourra donner un signal avec des interférences limitées.

 Echange de solvant : les analyses en spectrométrie de masse requièrent des échantillons dans un environnement spécifique. La SPE offre la possibilité de convertir la matrice de départ en un solvant compatible avec de telles analyses.

En contrôle antidopage, les échantillons sont fournis dans une matrice urinaire (milieu aqueux), contenant un grand nombre de contaminants et des analytes souvent à l’état de trace. Une SPE lors de la préparation d’échantillon permet de nettoyer l’échantillon, concentrer les analytes ciblés et les placer dans un milieu optimisé pour une analyse par spectrométrie de masse, faisant de cette technique une étape indispensable pour la méthode analytique de détection des stéroïdes.135

1.2. Analyse des stéroïdes en matrice simple (solvant)