Effet de matrice

Comme il a été évoqué à plusieurs reprises dans les paragraphes précédents, une matrice complexe comme l’urine peut poser de nombreux problèmes lors d’une analyse à des concentrations faibles (analyte de l’ordre de plusieurs unités de ng/mL). On trouve dans l’urine un grand nombre de composés allant de la petite molécule organique aux protéines à des concentrations extrêmement variables. La haute sélectivité de la LC-MS/MS ne garantit pas l’élimination efficace des interférences liées aux impuretés endogènes. De ce fait, les analyses par ESI peuvent être affectées par des effets de suppression d’ionisation causés par la présence de la matrice. Ce phénomène est appelé « effet matrice » et peut être responsable de données erronées et non reproductibles.221

Afin d’évaluer l’effet matrice sur la détection des stéroïdes d’intérêt, un protocole décrit dans la littérature a été appliqué.222 Un blanc d’urine a été préparé selon la méthode « SPE, hydrolyse et LLE » et injecté en LC. A l’aide d’un montage en « T » (cf : Schéma 28 page 107), une solution de stéroïde introduite à l’aide d’une seringue rencontre le flux de la LC contenant l’échantillon d’urine. On obtient ainsi un signal où le composé est toujours présent et qui varie en fonction des impuretés présentes dans la matrice. Si la matrice ne contient aucune interférence, on aboutit donc à une ligne plate correspondant au signal de stéroïde étant détecté en continu. Toute déviation de cette ligne continue correspond à un composé de la matrice interférant avec les transitions du stéroïde étudié. Cette expérience a été réalisée avec le fluoxymestérone-m à 10 ng/mL dans la seringue et une extraction de l’urine avec TBME (Figure 30).

Figure 30. Chromatogramme TIC montrant l’effet de la matrice extraite au TBME sur le

fluoxymestérone-m à 10 ng/mL.

On observe des contaminations très abondantes à des temps de rétention de 5,50 min, 7,25 min, 7,92 min, et 8,95 min. Ces signaux sont très intenses et montrent que des espèces présentes dans la matrice répondent aux transitions du fluoxymestérone-m. Cependant les temps de rétention observés pour ces interférences sont éloignés de celui du stéroïde et celles-ci ne créent donc pas d’effet de suppression de signal lorsque le fluoxymestérone-m élue de la colonne (d’où le suivi en mode TIC). L’effet matrice est ici clairement visible mais ne pose de pas de problème pour l’analyse de ce composé. L’expérience est répétée avec la 6-oxo-androsténendione à 10 ng/mL avec deux échantillons de la matrice : une fois extrait avec du TBME et l’autre avec du n-pentane (Figure 31).

Figure 31. Chromatogramme TIC montrant l’effet de la matrice extraite au (a) TBME et (b)

n-pentane sur la 6-oxo-andronsténendione à 10 ng/mL. Les flèches indiquent les temps de rétention du signal dédoublé de la 6-oxo-androsténendione.

Le cas de la 6-oxo-androsténendione est intéressant puisqu’il apporte non seulement des informations sur l’effet matrice mais également sur l’influence du solvant d’extraction lors de l’étape de LLE. On peut voir que lorsque la matrice a été préparée et extraite avec le TBME, le signal observé est important ce qui dénote la présence de contaminants dans la matrice qui se fragmentent de manière identique au stéroïde, induisant du signal pour les transitions sélectionnées (Figure 31a). Il faut noter que ces interférences sont bien moins intenses que celles observées avec le fluoxymestérone-m. Un pic d’interférence matricielle important élue à 5,26 min soit quasiment en même temps que le premier pic de la 6-oxo lors de l’extraction TBME. Cela pose problème puisque la présence de ce contaminant peut induire une suppression de l’ionisation du stéroïde et réduire son signal, donc la sensibilité de la méthode. Si l’on s’intéresse au chromatogramme obtenu avec la matrice extraite au n-pentane (Figure 31b), on voit que le signal est très homogène (la représentation est normalisée ce qui peut induire en erreur mais un compte d’ion total (Total Ion Count, TIC) de 323 correspond essentiellement à du bruit de fond) et que la matrice ne créé pas d’interférences

t_r(6-oxo) = 5,30 et 5,60 min

a.

lorsqu’il peut être utilisé, produit des échantillons beaucoup plus propres. Comme la 6-oxo-androsténendione est extraite avec le n-pentane elle ne subit pas non plus d’effet matrice.

Enfin la même procédure a été répétée pour le furazabol-m à 10 ng/mL. Deux échantillons de matrice sont extraits respectivement avec TBME et n-pentane pour l’injection en LC (Figure 32).

Figure 32. Chromatogrammes montrant l’effet de la matrice extraite au (a) TBME et (b)

n-pentane sur le furazabol-m à 10 ng/mL.

On voit que la matrice a un effet prononcé sur la réponse du furazabol-m avec un grand nombre de pics d’interférences sur les chromatogrammes. Les profils sont très similaires que l’extraction soit réalisée avec le TBME ou le n-pentane, cependant on peut noter que le pic de contamination coïncidant avec le temps d’élution du stéroïde (8,49 min) est plus faible dans le cas du n-pentane. Ce solvant est donc plus adapté lors de l’étape de LLE pour réduire l’effet matrice lors des analyses du furazabol-m. Il est à noter que l’interférence éluant à 9,41 min est généralement observée dans la transition Q0 du composé mais que celui-ci donne un signal assez intense pour compenser l’effet matrice.

TBME

n-pentane

t_r(furazabol-m) = 8,45min

a.

Ces expériences montrent que la méthode employée au niveau de la préparation d’échantillon et le choix des transitions SRM permettent d’éviter des effets indésirables liés à la présence d’une matrice complexe. Cet avantage est également le résultat de l’utilisation de l’ESI en mode négatif qui ionise plus difficilement les molécules et aboutit à un bruit de fond souvent moins élevé qu’en mode positif.