Extraction des principes actifs

La voie de la macération a été choisie pour extraire les principes actifs de cette espèce végétale, afin de préserver l’intégrité de la nature de la molécule anti vibrio cholérique à déterminer à long terme.

 La macération

La macération est une opération qui consiste à laisser la poudre du matériel végétal en contact prolongé avec un solvant pour en extraire les principes actifs. C’est une extraction qui se fait à température ambiante.

Afin d’accélérer le processus, l’extraction des principes actifs de Morinda morindoides a nécessité une augmentation et fixation de la température à 80 °C, à partir d’une plaque magnétique chauffante, sous agitation magnétique.

II.2.1.1. Préparation de l’extrait total aqueux

Les feuilles de Morinda morindoides, plante codifiée, (BGG), préalablement séchées ont été pulvérisées par un broyeur mécanique de type IKA^® LabortechniK STAUFEN ; Germany : JANKE & KUNKEL). La poudre fine obtenue a servi à préparer les différents principes actifs.

Ainsi, L’Extrait total aqueux a été obtenu selon la méthode de BAGRE et al. (2006) (Figure

20) : cent grammes de poudre végétale ont été macerés dans un litre d’eau distillée, puis

homogéinisés sous agitation magnétique pendant vingt quatre heures à une température de 80 °C, (à l’aide d’un agitateur magnétique de type RTC B, IKA^® (Labortechnik STAUFEN ; Germany : JANKE & KUNKEL). L’homogénat obtenu est filtré successivement deux fois sur du coton hydrophile et ensuite sur du papier Wattman^®, (diamètre =150 mm, Nr. 0859, Marke SELECTA, Germany : CARL SCHLEICHER & SCHüLL). Le filtrat est évaporé à pression réduite à 45 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif du type RVO5-ST, IKA^® (Labortechnik ; Germany). Ce concentré de produit obtenu de couleur noirâtre est ensuite lyophilisé pour devenir une poudre noirâtre, constituant l’extrait total aqueux qui est codifié : (E.Taq.).

II.2.1.2. Préparation de l’extrait éthanolique 70 %1 et l’extrait résiduel

L’extrait éthanolique 70 % et l’extrait résiduel proviennent de l’extrait total aqueux selon la méthode suivante (BAGRE et al., 2006, 2007 ; MOROH et al., 2008) : cinq (5) grammes d’extrait total aqueux sont dissouts dans cent millilitres d’une solution éthanol absolu - eau (70 : 30 ; V/V), homogénéisés à partir d’un agitateur magnétique pendant 24 H. Le mélange obtenu est

laissé au repos dans une ampoule à décantation jusqu’à obtention de deux phases : la phase supérieure ou surnageant, contenant les éléments alcoolo- hydro solubles est separée de la phase inferieure ou résidu. Ces phases (surnageant et résidu) sont concentrées séparément par évaporation à pression reduite à 45ºC à partir d’un évaporateur rotatif, du type RVO5-ST IKA^®. Les concentrés de produits issus du surnageant et du résidu sont lyophilisés et rendus en poudres, constituant respectivement l’extrait hydroéthanolique ou l’extrait éthanolique 70 %1 (E.ETH70 %) et l’extrait résiduel (E.Rés.) de Morinda morindoides (Figure 21).

II.2.1.3. Préparation de l’extrait éthanolique 70 % 2 (E.ETH 70 % vég.)

L’extrait éthanolique 70 %2 été obtenu à partir d’une légère modification de la méthode décrite par BAGRE et al. (2006, 2007) et MOROH et al. (2008) : cent grammes de poudre végétale ont été macerés dans un litre d’une solution éthanol absolu-eau (70 : 30 ; V/V), puis homogéinisés sous agitation magnétique pendant vingt quatre heures à une température de 80 °C, (à l’aide d’un agitateur magnétique de type RTC B, IKA^® (Labortechnik STAUFEN ; Germany : JANKE & KUNKEL). L’homogénat obtenu est filtré successivement deux fois sur du coton hydrophile et ensuite sur du papier Wattman^®, (diamètre =150 mm, Nr. 0859, Marke SELECTA, Germany : CARL SCHLEICHER & SCHüLL). Le filtrat est évaporé à pression réduite à 45 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif du type RVO5-ST, IKA^® (Labortechnik ; Germany). Ce concentré de produit obtenu est ensuite lyophilisé constituant l’extrait éthanolique 70 % 2 ou l’extrait éthanolique 70 % végétal, codifié : (E.TH70 % vég) de Morinda morindoides (Figure 22).

II.2.1.4. Préparation de l’Extrait c romatograp ique aqueux (BGG-F5)

Le fractionnement de l’extrait total aqueux de Morinda morindoides a été inspiré de la technique décrite par GUEDE-GUINA et al. (1993) et reprise par ACKAH et al. (2008) et

KOFFI et al. (2010). Selon cette technique, l’extrait chromatographique aqueux (BGG-F5) a été obtenu selon la méthode suivante : Trois cent milligrammes de l’extrait total aqueux sont dissous dans cinq mL d'eau distillée (soit 60 mg / mL). Le tout est passé à travers une colonne

(1,8 x 50 cm) de gel de sephadex G50, avec de l’eau distillée comme phase mobile. Le débit moyen est de 2 millilitres (mL) par minute. Cinq (5) fractions de dix (10) mL chacune, ont été séquentiellement collectées séparément, et notées respectivement F1, F2, F3, F4, F5. La cinquième fraction ou BGG F5, qui réduit l’activité duodénale (BAHI, 1998), a été retenue. Cette fraction de couleur orangée est collectée, concentrée à pression réduite à 45 °C à l’aide d’un

évaporateur rotatif du type RVO5-ST, IKA^® (Labortechnik ; Germany), par évaporation à pression réduite et lyophilisée pour donner de la poudre.

100 g de poudre de Morinda morindoides (BGG)

Résidus _Filtrat

Évaporation à pression reduite à 45 ºC à l’aide d’un évaporateur rotatif du type RVO5-ST IKA^® et

lyophilisation Double filtration sur du coton hydrophile

et sur du papier Whatman, 3 mm

Macération à 80 ºC dans 1 L d’eau sur un agitateur magnétique de type RTC B IKA, pendant 24 H

Extrait total aqueux : E.Taq.

Avec une masse moyenne m = 13,915 g, oit un rendement moyen η = 13,915%

Figure 20 : Méthode de préparation de l’extrait total aqueux (E.Taq.) de Morinda morindoides (BAGRE et al., 2006).

5 g d’Extrait total aqueux (E.Taq.)

Phase inférieure _{Phase supérieure}

Évaporation à pression reduite à 45 ºC à l’aide d’un évaporateur rotatif du type RVO5-ST IKA^® et lyophilisation

Décantation

Dissolution et homogénéisation dans 100 mL d’une solution éthanol absolu-eau (70 :30 ; V V), sur un agitateur magnétique de type RTC B

IKA, pendant 24 H

Extrait étanolique 70 % : E.ETH70 %. Avec une masse moyenne m = 1,1525 g et un rendement moyen η = 23,05% Extrait Résiduel :

E.Rés.

Figure 21 : Méthode de préparation de l’extrait éthanolique 70 % (E.ETH70 %) et de l’extrait

résiduel (E.Rés.) de Morinda morindoides.

100 g de poudre de Morinda morindoides (BGG)

Résidus Filtrat

Évaporation à pression reduite à 45 ºC à l’aide d’un évaporateur rotatif du type

RVO5-ST IKA^® et lyophilisation Double filtration sur du coton hydrophile

et sur du papier Whatman, 3 mm

Macération à 80 ºC dans 1 L d’une solution éthanol absolu-eau (70 : 30 ; V V), sur un agitateur magnétique de type RTC B IKA,

pendant 24 H

Extrait éthanolique 70 % 2: E.ETH 70 % vég. Avec une masse moyenne m = 8,66 g et un rendement moyen η = 8,66%

Figure 22 : Méthode de préparation de l’extrait éthanolique 70 % 2 (E.ETH70 % vég) de Morinda morindoides (BAGRE et al., 2006, 2007 ; MOROH et al., 2008) ).

Ces cinq extraits (E.Taq., E.ETH70 %, E.ETH70 %vég., E.Rés., BGGF5), sont conservés dans des tubes à essai en verre, à 4 °C, à l’abri de la lumière pour les tests bactériologiques ultérieurs.