Le MV contient deux sous-types de neurones DA, les neurones A9 TH+/Girk2+ de la SNpc et les neurones A10 TH+/calbindine+ de la VTA. En outre, le prélèvement de tissu provenant du mésencéphale ventral effectué pour la transplantation contient à la fois les sous-types de neurones dopaminergiques de la VTA et de la SNpc. La transplantation de neurones DA provenant de MV d’embryons de souris (Thompson et al., 2005) ou humain (Mendez et al., 2005) dans le striatum hôte et co-exprimant Girk2 est capable d’innerver le striatum hôte. A l’inverse, les neurones DA co-exprimant la calbindine ne possédant pas cette capacité.
Nous avons examiné, la distribution des neurones DA exprimant soit Girk2 soit calbindine au sein des greffons placés dans le striatum (n = 7) ou dans la SNpc (n = 6). Nous avons observé dans les deux conditions de transplantation (intrastriatale et intranigrale), que les neurones GFP+/Girk2+ sont retrouvés préférentiellement à la périphérie du transplant et présentent une morphologie large et angulaire caractéristique des neurones dopaminergiques de la SNpc (Figure 40). A l’inverse, les neurones GFP+/calbindine+ ont été retrouvés au centre du transplant et leur morphologie, caractéristique des neurones DA de la VTA était petite et sphérique (Figure 40). La répartition de ces neurones DA retrouvés à la périphérie du transplant (pour les neurones GFP+/Girk2+) ou au centre du transplant (pour les neurones GFP+/calbindine+) est en accord avec les résultats observés dans de précédentes études, après la greffe de tissu mésencéphalique (Mendez et al., 2005; Thompson et al., 2005, Gaillard et
103 Figure 40 : Illustration en microscopie confocale de l’expression des marqueurs dopaminergiques dans les transplants intranigraux et intrastriataux. (A-E) Transplantation intranigrale. (F-J) Transplantation intrastriatale. Les flèches blanches montrent les neurones dopaminergiques co-exprimant la TH (en vert) et Girk2 (en rouge). Les flèches rouges identifient les neurones dopaminergiques TH+ co-exprimant la calbindine (en bleu). Les flèches jaunes révèlent les neurones dopaminergiques co-exprimant TH+/Girk2+/Calbindine+. Les cellules doublement marquées TH+/Girk2+ sont retrouvées préférentiellement à la périphérie des transplants intranigraux comme intrastriataux et présentent une morphologie large et angulaire caractéristique des neurones dopaminergiques de type A9. A l’inverse, les cellules TH+/Calbindine+ sont retrouvées principalement au centre des transplants et affichent une morphologie petite et ronde typique des neurones dopaminergiques A10. Barre d’échelle : 60µm.
Nous avons par la suite, réalisé une quantification du nombre de neurones GFP+/Girk2+ et GFP+/calbindine+ au sein des transplants sur 1 des 6 séries de coupes pour 6 animaux transplantés en intranigral et 7 animaux transplantés en intrastriatal. Cette quantification a révélé que la majorité des neurones dopaminergiques GFP+ étaient également Girk2+. Plus précisément, dans le cas de la transplantation intrastriatale, sur 653±156 neurones GFP+ retrouvés dans le greffon, 344±85 étaient positifs pour Girk2. De la même façon, sur 343±74 neurones GFP+, 154±37 co-exprimaient la calbindine. En parallèle, dans le cas de greffons
104 positionnés dans la substance noire, sur 1231±217 neurones GFP+, 674±126 l’étaient également pour Girk2 et sur 685±138 neurones GFP+, 334±74 co-exprimaient la calbindine. En conséquence, la proportion de neurones GFP+/Girk2+ au sein des transplants intrastriataux et intranigraux était respectivement de 52,1% et 54,1% (Figure 41). De la même manière, nous avons déterminé que la proportion des neurones GFP+/calbindine+ dans les deux conditions de transplantation intrastriatale et intranigrale était respectivement de 44,2% et 47,2% (Figure 41).
De plus, considérant d’une part que le nombre de neurones GFP+ est significativement plus important dans le cas de greffes intranigrales en comparaison des greffes intrastriatales et d’autre part que la proportion de neurones GFP+/Girk2+ et GFP+/calbindine+ est similaire pour les deux conditions de transplantation, le test de Student non apparié nous permet de dire que la greffe intranigrale contient à la fois un nombre significativement plus important de neurones GFP+/Girk2+ et de neurones GFP+/calbindine+ par rapport à la greffe intrastriatale (Figure 41 ; p < 0,05).
Figure 41 : Quantification du nombre de neurones dopaminergiques dans le transplant. Moyenne ± sem du nombre de cellules GFP+ co-exprimant la protéine Girk2 en (A) ou calbindine (B) au sein de la greffe intrastriatale (en blanc ; n = 7) ou intranigrale (en bleu ; n = 6). (C) Proportion de neurones GFP+/Girk2+ ou GFP+/calbindine+ calculée pour chaque condition de transplantation. La comparaison entre les groupes pour chaque condition a été réalisée à partir d’un t-test non apparié. * : p < 0,05.
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D. Établissement de contacts synaptiques réciproques entre les
neurones greffés et les neurones de l’hôte
Afin d’analyser le niveau d’intégration synaptique des neurones dopaminergiques transplantés, nous avons examiné, par microscopie électronique, l’établissement des contacts synaptiques entre les neurones de l’hôte et les neurones transplantés (Figure 42). Pour pouvoir visualiser en microscopie électronique les neurones greffés, nous avons utilisé un anticorps couplé à des particules d’or colloïdales. Nous avons mis en évidence que les neurones greffés sont innervés par les axones de l’hôte aussi bien en position striatale (Fig. 42A) qu’en position nigrale (Fig. 42C). Nous avons également montré que les axones issus des neurones greffés, établissent des contacts synaptiques avec les neurones striataux de l’hôte. En effet, nous avons observés de nombreux contacts synaptiques axo-dendritiques pour des greffes en position intrastriatale (Fig. 42B) et intranigrale (Fig. 42D). L’établissement de ces contacts synaptiques réciproques entre les neurones greffés et les neurones de l’hôte montrent l’intégration synaptique des neurones greffés dans les circuits de l’hôte.
106 Figure 42 : Etablissement des contacts synaptiques réciproques entre l’hôte et le transplant. Les flèches rouges montrent les contacts axo-somatiques entre les axones des neurones de l’hôte et les neurones greffés en position striatale (A) ou nigrale (C). Établissement de contacts axo-dendritiques entre les axones des neurones greffés et les dendrites des neurones striataux de l’hôte pour des greffes en position striatale (B) et nigrale (D). Les flèches vertes montrent les particules d’or. H : Hôte ; T : Transplant.
II. Évaluation de la fonctionnalité des neurones
dopaminergiques du MV transplantés en
condition intrastriatale versus intranigrale
Comme nous l’avons décrit précédemment, l’organisation de l’activité motrice est fortement régie par la voie dopaminergique nigro-striée. Dans le cadre de la MP, la transmission des informations motrices au cortex cérébral est altérée du fait de la disparition de l’innervation dopaminergique et est à l’origine des symptômes moteurs de cette maladie. Sur le plan neuroanatomique, nous avons pu mettre en évidence à la fois la survie et l’intégration des neurones transplantés au sein des deux structures nigrales et striatales ainsi que l’expression des marqueurs dopaminergiques au sein des greffons. Cette étude neuroanatomique a été complétée par l’évaluation de l’intégration fonctionnelle des neurones transplantés à la fois par une batterie de tests comportementaux ainsi que par une approche électrophysiologique.
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