Expression des protéines par western blot :

Cette technique nous a permis de mesurer l’effet du médicament ou des milieux conditionnés sur l’expression de certaines protéines par les HUVEC.

II.5.a.

Une certaine quantité de protéines est séparée par électrophorèse SDS PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de type nitrocellulose puis incubées avec un anticorps spécifique de la protéine à étudier (anticorps primaire). La liaison de l'anticorps à l'antigène (la protéine d'intérêt) est visualisée à l’aide d’un anticorps secondaire (dirigé contre le premier anticorps) et couplé à un fluorophore. La détection s’effectue par chimiluminescence. Les résultats sont normalisés par rapport aux valeurs obtenues avec une protéine dont l’expression n’est pas influencée par l’expérience.

II.5.b.

Kit de dosage des protéines : BCA^® protein assay kit (Thermo scientific, France).

Tampon de RIPA : 20 mM Tris-HCL pH 8, 1 % TritonX-100, 200 mM NaCl, 1mM EDTA. Le tampon de lyse RIPA est complémenté extemporanément avec des inhibiteurs de protéases et de phosphatases :

- complete 1X: (Roche, France)

- 1 % d’inhibiteurs de phosphatases (phosphatase inhibitor coktail 1 et 2, Sigma-Aldrich, France)

- et PMSF (phenyl methane sulfonyl fluoride (Sigma-Aldrich, France).

Marqueur de taille (PM) : Precision Plus ProteinTM Standards dual color (Biorad, France) Tampon de charge 4X (laemmli) : 8 % SDS, 10 % ß mercapto-éthanol, 30 % glycérol, 0,02 % bleu de bromophénol, Tris-HCl 0,25M

Tampon de migration : 18,19 g Tris-Base, 3 g SDS, 86,95g Glycine, ED qsp 3L

Tampon de transfert 10X : 119,2 g Tris Base, 58,6 g glycine, 7,5 g SDS, 2L ED 18MΩ. Tampon de transfert 1X : 100 mL

Tampon de transfert 10X, 100 mL méthanol, 700 mL ED 18MΩ

Tampon de lavage 1X (TBS) : 100mL tampon TBS 10X + 900 mL d’ED 18MΩ. Tampon de lavage (TBST) : 1 L de Tampon TBS + 1 mL de Tween20 (Sigma, France) Tampon de blocage (TBST-lait) : 1 L de Tampon TBS + 5 % lait écrémé (Régilait) Membrane de transfert en PVDF (polyvinylidene fluoride) (0,45 µm, Amersham, France) Papier filtre (Biorad, France).

Substrat de révélation par chimiluminescence : SuperSignal WestPico Chemiluminescent Substrate (Thermo scientific, France).

Système électrophorèse et de transfert liquide : Mini-Protean®Tetra cell (BioRad, France) Générateur PowerPacTM HC (Biorad, France).

Analyseur d’image : ChemidocTMXRS (BioRad, France) et le logiciel d’analyse d’image Quantity One (BioRad, France).

Composition des gels de polyacrylamide :

Réactifs Fournisseur 10% 8% ^{Concentration} (5%) Acrylamide/bis 29 :1 (mL) Biorad, France 2,5 2 0,625

dH2O (mL) 2,4 2,9 1,825

Tris/HCl 1,5M pH 8,8 (mL) Biorad, France 5 5 néant Tris/HCl 0,5M pH 6,8 (mL) Biorad, France néant néant 2,5 SDS 10% (µl) Sigma, France 100 100 50 TEMED (µl) Biorad, France 8,5 8,5 5 APS 10% (µl) Biorad, France 85 85 50

Tableau 16 : composition des gels de polyacrylamide (technique western blot).

II.5.c.

1) Les cellules endothéliales sont ensemencées à une densité de 32000 cellules/cm² dans des flasques 25 cm².

2) Après 24 heures d’incubation, les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS puis incubées avec 5 mL des différents milieux conditionnés ou contrôles préparés avec ou sans cetuximab. 3) Les cellules sont laissées à incuber pendant 24 heures.

II.5.d.

1) À l’issue du protocole expérimental, le milieu de culture des cellules est éliminé.

2) Les cellules sont rincées 3 fois avec PBS et incubées avec 300 µL de tampon de lyse pendant 30 minutes sur un lit de glace.

3) Le tapis cellulaire est gratté puis récupéré dans des microtubes.

4) Les échantillons sont ensuite passés au travers d’une aiguille à seringue 23 G : 10 fois. 5) Le lysat cellulaire obtenu est ensuite aliquoté et conservé à - 20°C jusqu’à analyse par western blot.

6) Le dosage du contenu total en protéines dans le surnageant est réalisé sur le principe de la méthode de Lowry à l’aide du kit BCA et utilisé selon les recommandations fournies par le fabriquant. Les concentrations sont calculées en µg/mL à partir d’une gamme étalon de BSA (fourni dans le kit).

II.5.e.

1) Les mini-gels sont coulés (Cf. tableau 16), mis à polymériser (30 minutes pour le gel de séparation, 10 min pour le gel de concentration) à température ambiante et montés sur le système d’électrophorèse après avoir éliminé les peignes avec précaution.

2) la cuve est remplie avec le tampon de migration.

3) les échantillons sont mélangés avec du tampon de charge (1X final) et dénaturés par chauffage à + 95°C pendant 5 minutes.

4) 25 µg de protéines sont déposés dans chaque puits (+ 1 puits contenant 10 µl du marqueur de taille).

5) La migration s’effectue à 100 V pendant 2 heures.

6) Le système est démonté et les gels sont déposés sur une membrane PVDF activée au préalable par des 3 bains successifs dans du méthanol et du tampon de transfert. L’ensemble est mis à transférer dans le système de transfert liquide (Transblot) correctement assemblé pendant 1 heure à 350 mA.

7) Les liaisons non spécifiques des membranes sont bloquées pendant 1 heure sous agitation par incubation dans le tampon de blocage.

8) Les membranes sont incubées avec les anticorps spécifiques de la protéine à étudier pendant 1 nuit à + 4°C sous agitation (Cf. tableau 17).

9) Après 3 lavages avec le tampon de lavage TBST, les membranes sont incubées avec l’anticorps secondaire couplé à la HRP (Cf. tableau 17) pendant 1 heure à température ambiante sous agitation suivi de 3 lavages de 10 min dans du tampon de lavage TBST.

10) La membrane est immergée dans la solution de substrat de révélation pendant 5 min. 11) Les membranes sont ensuite séchées et déposées sur le plateau de l’analyseur d’image. 12) La révélation des bandes s’effectue par illumination des membranes pendant une durée variable selon la protéine cible (de 0,5 à 10 minutes).

13) L’intensité de chaque bande est déterminée à l’aide du logiciel « Quantity One ». Les résultats sont ensuite normalisés en utilisant la protéine β-tubuline comme référence et présentés en expression relative par rapport aux extraits protéiques des cellules non traitées. Anticorps Fournisseur Espèce Dilution anti-human β-tubulin

(polyclonal)

Santa Cruz,

TEBU, France ^{Souris 1/1000} Anti-human VEGFR-2

(monoclonal)

Santa Cruz,

TEBU, France ^{Souris 1/1000} Anti-human EGFR (polyclonal) Cell Signaling Technologies, France Lapin 1/1000 Anti-human PECAM-1 (monoclonal) DakoCytomation, France ^{Souris 1/1000} Anti-human Notch-4 (polyclonal) Santa Cruz,

TEBU, France ^{Lapin 1/1000} horseradish peroxidase

(HRP)-conjugated secondary antibody

Santa Cruz, TEBU, France

Souris

Lapin ^1/10000

Tableau 17 : Liste des anticorps avec leur dilution utilisés pour le western blot. Les anticorps sont dilués avec du tampon TBST + 5% de lait demi-écrémé.