Pour les tentatives de surexpression chez E. coli, en plus des constructions citées ci-dessus, nous avons également testé l’expression de la sous-unité c avec un His-Tag en N-terminal (plasmide pET28atpEBK6H), un tag en C-terminal (plasmide pTBSG/Rv1305) (Qin, Hu et al. 2008), et en protéine de fusion avec la MBP (plasmide pTBMAL/Rv1305). Quatre souches différentes de E. coli, BL21, BL21 Codon Plus, C43 et C44, ont été testées. L’ensemble des tests est récapitulé dans l’annexe 3.
Si on exclue la protéine de fusion avec la MBP, l’expression de la sous-unité c de M. tuberculosis chez E. coli avec ou sans His-Tag n’a pas, semble-t-il, permis la production de la protéine, qui n’était pas visible sur gel SDS-PAGE ni détectable sur Western Blot. Malgré les différentes constructions, les tentatives de variation de la température, du temps d’induction et surtout de la souche de E. coli, aucune production n’a pu être obtenue.
A l’inverse, l’expression de la sous-unité c de M. tuberculosis sous forme de protéine de fusion avec la MBP a permis la production de la protéine chez E. coli BL21 Codon Plus. Cette technique d’expression a déjà été utilisée avec succès pour la production chez E. coli de plusieurs protéines membranaires de M. tuberculosis (Korepanova, Moore et al. 2007). La construction plasmidique pMALc2 permet la production de la sous-unité c en fusion avec la MBP avec un His-Tag en C-terminal de la MBP (protéine MBP-His-suc), alors que la construction plasmidique PTBMAL/Rv1305 permet la production d’une sous-unité c - MBP avec un His-Tag en N-terminal de la MBP (protéine His-MBP-suc). Les deux protéines recombinantes se caractérisent par une masse moléculaire théorique d’environ 51 kDa (MBP 42.5 kDa, sous-unité c 8 kDa) et il est possible de les purifier sur résine de nickel ou sur résine d’amylose.
Dans la pratique, nous avons obtenu des résultats identiques pour l’expression et la purification des protéines MBP-His-suc et His-MBP-suc :
quel que soit la méthode de lyse cellulaire employée : sonication ou Presse de French ;
que la purification soit faite sur résine de nickel ou d’amylose ;
quel que soit le détergent et la concentration à laquelle il a été utilisé : DDM 0.02%, DDM 0.04%, TriDM 0.005%.
Le profil de migration sur gel SDS-PAGE des fractions purifiées à partir des protéines solubles et membranaires (surnageants S2 et S3 de l’annexe 2) est identique, la protéine majoritaire étant celle correspondant à la protéine de fusion à la masse moléculaire attendue de 51 kDa (Figure 62). Sur le gel (Figure 62), nous observons également une bande correspondant à une protéine de masse moléculaire d’environ 43 kDa, qui serait la MBP endogène de E. coli copurifiée sur résine d’amylose, ainsi que plusieurs bandes de haut poids moléculaire. Ces bandes de haut poids moléculaire disparaissent lors d’un traitement des fractions à l’urée 7 M, qui va dénaturer tous les complexes protéiques contenant des interactions hydrophobes fortes. Ces bandes doivent donc correspondre à des multimères de MBP-His-suc interagissant entre eux via la sous-unité c (schéma Figure 62). Sur le gel de la Figure 62, nous voyons que la MBP-His-suc est plus abondante dans la fraction correspondant aux protéines solubles (piste 1) que dans celle correspondant aux protéines membranaires (piste 3). Nous avons obtenu le même profil de migration sur gel SDS-PAGE pour la protéine de fusion His-MBP-suc purifiée.
Figure 62. Gel SDS-PAGE 12% de l’élutions après purification sur résine d’amylose de la protéine de fusion MBP-His-suc (1) Purification de la fraction contenant les protéines
solubles (S2), (2) marqueur de poids moléculaire, (3) purification des protéines membranaires solubilisés en DDM (S3). Les carrés rouges indiquent à quel complexe
protéique correspondent les protéines visibles sur gel : MBP seul, MBP-sous-unité c, dimère–trimère-pentamère… de MBP-His-suc (trois formes multimériques sont représentées mais il peut exister d’autres types de multimère). Les protéines visibles sur
On peut noter ici qu’une différence significative du rendement de la purification a été observée en fonction du détergent utilisé. Les purifications faites en utilisant les détergents DDM et TriDM ont permis de récupérer une quantité plus abondante de protéine par rapport à la purification avec le N-Lauroylsarcosine (entre 6 et 7.5 mg/ml de protéine pour les deux premiers et seulement 0.5 à 1 mg/ml pour le dernier)
Des tests de digestion pour séparer la sous-unité c de la MBP ont été faits à partir des deux protéines de fusion MBP-His-suc et His-MBP-suc. La protéine MBP-His-suc possède un site de coupure à la thrombine entre la MBP et la sous-unité c. La digestion avec la thrombine permet la coupure de la protéine de fusion, comme cela est visible sur gel SDS-PAGE (Figure 63). Après une heure de coupure, la protéine à 51 kDa (MBP-sous-unité c) disparait et la protéine d’environ 43 kDa (MBP seule) devient plus abondante ; plusieurs autres bandes de petites poids moléculaire apparaissent (Figure 63A). Le profil de la digestion ne change pas en fonction du détergent utilisé (Figure 63A). De même, après une digestion de 16 heures, les bandes de haut poids moléculaire correspondant aux complexes MBP-sous-unité c ne sont plus visibles sur gel SDS-PAGE (Figure 63B). Toutes les bandes de petit poids moléculaire visibles sur gel SDS-PAGE obtenues après digestion ont été analysées en spectrométrie de masse, mais la sous-unité c n’a jamais pu être détectée.
Figure 63. Gel SDS-PAGE à 16% d’acrylamide de la digestion de la protéine de fusion MBP-His-suc par la thrombine. (A) (1) Protéine non digérée, (2-3-4) protéine digérée respectivement pendant 1h, 2h et 4h dans un tampon avec du Triton X100 0.1%, (5-6-7)
protéine digérée respectivement 1h, 2h et 4h dans un tampon avec du DDM 0.02%. La flèche rouge indique la bande correspondant à la MBP digérée. (B) Protéine digérée 16
heures dans un tampon avec du (1) DDM ou du (2) Triton X100, (3) protéine non digérée.
La protéine de fusion His-MBP-suc possède un site de coupure à la protéase TEV entre la MBP et la sous-unité c. Le profil de digestion de la protéine sur gel SDS-PAGE est le même que pour la digestion à la thrombine (non montré) et la sous-unité c n’a pas pu être détectée parmi les protéines visibles sur gel analysées en spectrométrie de masse. L’utilisation de détergents différents n’a pas permis d’améliorer ce résultat.
La protéine MBP-His-suc purifiée a été utilisée pour des tests de cristallisation. Il a été montré que s’il existe des problèmes de coupure entre la MBP et la protéine d’intérêt, la protéine de fusion complète peut, dans certains cas, être cristallisée avec succès et permettre l’obtention de la structure (Smyth, Mrozkiewicz et al. 2003). Afin d’améliorer la purification de la protéine de fusion MBP-His-suc, les fractions d’élution de la résine d’amylose ont été concentrées et purifiées sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille afin de séparer la MBP-His-suc de la MBP endogène de E. coli (Figure 64).
Figure 64. Chromatographie de la purification sur résine d’amylose de la protéine MBP-His-suc. Le pic 1 correspond à la protéine de fusion, le pic 2 à la MBP endogène de E. coli.
Les tests de cristallisation effectués avec la protéine de fusion ont permis d’obtenir des cristaux dans la condition I du kit Crystal Screen I (0.02 M Calcium chloride dihydrate, 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 30% v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol) (Figure 65). Les clichés de diffraction aux rayons X obtenus à partir des cristaux montrent quelques tâches à très basse résolution. Malgré de
Figure 65. Cristaux obtenus avec la condition I du kit Crystal Screen I (0.02 M Calcium chloride dihydrate, 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 30% v/v
(+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol).
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n parallèle de l’approche par expression hétérologue de la sous-unité c de l’ATP synthase de M. tuberculosis chez E. coli, nous avons mis au point un protocole d’expression homologue et de purification de la sous-unité c de M. smegmatis chez M. smegmatis. Nous avons choisi ce modèle d’étude pour 2 raisons : (i) une expression homologue permet d’éviter les problèmes de toxicité liées à une expression hétérologue et (ii) M. smegmatis est une mycobactérie non pathogène à croissance rapide (temps de doublement de 2-3 heures).
Plusieurs constructions plasmidiques ont été faites et testées afin de faciliter cette purification. Les deux constructions, pLYGatpEsme et pLYGatpEmse6H (cartes en annexe 1), permettent la production de la sous-unité c de M. smegmatis, augmentant ainsi la quantité de la protéine dans la bactérie, respectivement sans et avec un His-Tag en N-terminal. Une troisième construction, pLYGatpDsme6H (carte en annexe 1), permet la production de la sous-unité β de l’ATP synthase de M. smegmatis avec un His-Tag en C-terminal.
Purification de la sous-unité c sans tag
Pour la purification de la sous-unité c sans tag, le protocole de purification de l’anneau c de I. tartaricus a été utilisé (Neumann, Matthey et al. 1998). Le protocole consiste en la solubilisation des protéines membranaires avec du Triton
E
X100 1% (surnageant S2, annexe 2) et à la récupération de l’ATP synthase avec une précipitation différentielle au PEG 6000. Les fractions obtenues ont été déposées sur gel SDS-PAGE (Figure 66).
Figure 66. Gel 14% de la purification de la sous-unité c de M. smegmatis selon le protocole de purification de l’anneau c de I. tartaricus (1) protéines non solubles dans du Triton X100 1%. (2) fraction correspondant à l’ATP synthase. (3) marqueur de taille. (4) fraction
correspondant à l’ATP synthase précipitée au TCA.
Dans la fraction correspondant théoriquement à l’ATP synthase, nous avons observé sur gel SDS-PAGE plusieurs protéines de poids moléculaire différents (puits 2 Figure 66). Faisant l’hypothèse que certaines des bandes de haut poids moléculaire pourraient correspondre à un multimérisation des sous-unités c, nous avons précipité au TCA cette fraction afin de déstabiliser l’anneau c (le TCA casse les liaisons hydrophobes fortes et permet de précipiter les protéines pour pouvoir les concentrer en les resuspendant dans un volume plus petit) afin de voir si une des bandes de haut poids moléculaire, correspondant à l’anneau c, disparaissait au profit d’une bande de petit poids moléculaire (monomères de sous-unité c). Aucune modification n’a été observée après la précipitation au TCA (puits 4 Figure 66).
Toutes les protéines visibles sur le gel ont été analysées par spectrométrie de masse mais aucune d’entre elles ne correspondait à une des sous-unités de l’ATP synthase.