Construction d’un vecteur d’inactivation

2.7.1. Première stratégie pour la construction du vecteur suicide

Résumé des étapes (Figure 34) :

Clonage de la cassette d’inactivation dans le vecteur pCR2.1-TOPO Clonage de la cassette d’inactivation dans le vecteur pGOAL19

Figure 34. Schéma des étapes de la première stratégie pour la construction du vecteur d’inactivation.

2.7.1.1. Clonage de la cassette d’inactivation dans le vecteur pCR2.1-TOPO

La cassette d’inactivation du gène atpE amplifiée par LFH-PCR a été extraite d’un gel d’agarose 1% avec le kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Elle a ensuite été réamplifiée avec les amorces atpE1int et atpE4int avant d’être clonée dans le vecteur pCR2.1-TOPO (carte en annexe 1 - Invitrogen) selon le protocole du kit. Ces amorces contiennent un site de restriction pour l’enzyme BamHI (en vert) :

atpE1int : GGATCCCTGGTGATGAGACCAGCAT atpE4int : GGATCCACGATCTCGGCGGCCTTGTT

Le vecteur ainsi obtenu, appelé pTOPOcassette (Figure 34), a été transformé dans E. coli TOP10 par électroporation et les colonies sélectionnées sur milieu BHI contenant 50 μg/ml d’ampicilline.

2.7.1.2. Clonage de la cassette d’inactivation dans le vecteur pGOAL19

Le vecteur pGOAL19 (Figure 34, carte en annexe 1) est un outil créé dans le but d’inactiver des gènes chez les mycobactéries (Parish and Stoker 2000) et il nous a été fourni par T. Parish du Département des Maladies Infectieuses et Tropicales de la London School of Hygiene and Tropical Medecine de Londres. Il contient une origine de réplication pour E. coli, un gène de résistance à l’ampicilline, un gène de résistance à l’hygromycine et un gène de sensibilité au sucrose. Tous les gènes marqueurs (sauf le gène de résistance à l’ampicilline) sont précédés d’un promoteur fort pour les mycobactéries.

Le vecteur pGOAL19 a été digéré avec l’enzyme de restriction BamHI (37°C pendant 16 heures) et ses extrémités ont été déphosphorilées avec 1 U de shrimp alkaline phosphatase (Roche) 1 heure à 37°C afin d’empêcher une ligation sur lui-même.

La cassette d’inactivation contient trois sites de coupure pour BamHI : deux sites aux extrémités insérés avec les amorces de la PCR et un site interne à la séquence. Le plasmide pTOPOcassette a été digéré partiellement (6 minutes à 37°C) avec BamHI de façon à récupérer une cassette digérée seulement aux

le kit QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene) afin d’éliminer le site BamHI à l’intérieur de la séquence avec les oligos atpFmutS et atpFmutAS :

atpFmutS : GCTGGCCAGCAGGATTCTCGGCGTCGACGTG atpFmutAS : CACGTCGACGCCGAGAATCCTGCTGGCCAGC

Les réactions de ligation entre le vecteur pGOAL19 et la cassette d’inactivation digérés BamHI ont été faite à 4°C pendant 16 heures. Plusieurs rapport vecteur:insert ont été utilisés : 1:0.5, 1:1, 1:3, 1:5, 1:8, et 1:10. Les ligations (pSUICIDE, Figure 34) ont été ensuite dialysées avant d’être transformées dans des cellules électrocompétentes de E. coli TOP10.

2.7.2. Deuxième stratégie pour la construction du vecteur suicide

Résumé des étapes (Figure 35) :

Amplification de 1000 pb en amont et en aval du gène atpE de M. smegmatis

Amplification du gène aph

Clonage de chaque fragment dans le vecteur pCR2.1-TOPO Clonage de chaque fragment dans le vecteur p2NIL

Insertion des marqueurs de sélection dans le vecteur p2NIL+cassette d’inactivation (p2NILIII)

Figure 35. Schéma des étapes de la deuxième stratégie pour la construction du vecteur d’inactivation.

2.7.2.1 Amplification de 1000 pb aux extrémités du gène atpE de M.

smegmatis et amplification du gène aph

Nous avons amplifié par PCR 1000 pb en amont et en aval du gène atpE de M. smegmatis (Figure 35) à partir du chromosome de M. smegmatis en utilisant les amorces atpEScaI, atpE2HindIII, atpE3PmlI, atpE4NotI :

atpE1ScaI : AGTACTGCGTTTGTCTTCAAGAGTTCGG atpE2HindIII : AAGCTTGCCGGCCGTGATGATGGCGTT atpE3PmlI : CACGTGACTCCTGGCCTTCGTAATCCG atpE4NotI : GCGGCCGCAGTTCGCTCAGGAAGCG

Le gène aph a été amplifié à partir du plasmide pk19 avec les amorces aphatpESHindIII et aphatpEASPmlI construites comme décrit par Ménard et al. (Menard, Sansonetti et al. 1993) :

aphatpESHindIII : AAGCTTTGACTAACTAGGAGGAATAAATGATTGAACAAGATGGA aphatpEASPmlI : CACGTGCATTATTCCCTCCAGGTATCAGAAGAACTCGTCAAGA Les 6 amorces contiennent à chaque extrémité un site de coupure unique dans la séquence de la cassette d’inactivation, unique dans la séquence du vecteur p2NIL et absent dans le vecteur pCR2.1-TOPO.

2.7.2.2. Clonage dans le plasmide pCR2.1-TOPO

Les trois produits d’amplification obtenus, c'est-à-dire les 1000 pb en amont du gène atpE (fragment 1), le gène aph et les 1000 pb en aval du gène atpE (fragment 2), ont été clonés séparément dans le vecteur pCR2.1-TOPO selon le protocole du kit (Figure 35).

Après extraction de chaque plasmide avec le kit Plasmid Midi (Qiagen), la digestion de chaque insert a été faite en deux étapes avec les enzymes appropriées : ScaI et HindIII pour le vecteur contenant le fragment 1, HindIII et PmlI pour celui contenant aph et PmlI et NotI pour celui contenant le fragment 2.

2.7.2.3. Clonage dans le vecteur p2NIL

Après digestion, chaque insert possède des extrémités digérées qui vont permettre la ligation des inserts entre eux et dans le vecteur p2NIL (carte du vecteur en annexe 1), soit avec trois réactions de ligation différentes, soit avec une ligation multiple. Le vecteur p2NIL, comme le vecteur pGOAL19, nous a été

fourni par Parish T. du Département des Maladies Infectieuses et Tropicales de la London School of Hygiene and Tropial Medecine de Londres.

Les réactions de ligation ont été faites à 4°C ou à 16°C pendant 16 heures. Pour la ligation simultanée des trois fragments, un rapport vecteur:inserts de 1:1:1:1 a été utilisé, et pour les ligations indépendantes de chaque fragment des rapports 1:2 et 1:5.

2.7.2.4. Insertion des autres marqueurs de sélection dans le plasmide p2NIL contenant la cassette d’inactivation

Le plasmide pGOAL19 a été digéré avec l’enzyme PacI. Cela permet la linéarisation de l’ADN portant les trois marqueurs de sélection contenus dans le vecteur : le gène de résistance à l’hygromycine, le gène de sensibilité au sucrose, et le gène LacZ. L’ADN linéaire contenant les gènes marqueurs a été cloné dans le vecteur p2NIL+cassette d’inactivation (p2NILIII) linéarisé PacI (Figure 35).