EXPANDING REGIONAL AND GLOBAL EXPORTS 1. Mauritius’ Export Potential

A família das AMPK são cinases que regulam processos celulares como apoptose, migração e proliferação celular. Nessa família destaca-se a ERK1/2 que integra uma via de transdução de sinais proliferativos. A via de PI3K/Akt/mTOR regula processos biológicos importantes nas células malignas, como sobrevivência, proliferação e metabolismo celular. Outro alvo terapêutico objeto de estudo deste trabalho é a proteína BRAF, pois, diversos tumores expressam uma mutação ativante nesse oncogene. [250]

Estudos de docking foram conduzidos, a fim de analisar a conformação e a energia de interação entre os compostos. Contudo, serão apresentados aqui, a ancoragem molecular dos compostos mais ativos (51, 52, 56, 57 e 58) e possíveis alvos terapêuticos descritos na literatura, como as enzimas PI3K, ER2, AMPK e

BRAF através do software AutoDock Vina.[251]

A estrutura cristalina da PI3K, ER2, AMPK e BRAF foram obtidas no Protein Data Bank (PDB) os códigos 1TVO, 1E7U, 2UV4 e 3OG7, respectivamente (Figura 97).

ERK2 (1TVO) PI3K (1E7U)

AMPK(2UV4) BRAF(3OG7)

Figura 98. Representação das estruturas cristalinas das proteínas ERK2, PI3K, AMPK e BRAF.

As proteínas PI3K, ERK2, BRAF e AMPK e foram preparadas com os seus ligantes, Noratiriol/FR180204 (ERK2), Wortmannim/LY294002 (PI3K) e Fenformina e HL010183 (AMPK e BRAF), de acordo com o protocolo descrito na literatura. [251] As caixas com as dimensões de 14x12x12Å para ERK2, PI3K e AMPK e 18x12x12Å para BRAF, com coordenadas x = 6.230, y = -3.419 e z = 17.175 para ERK2, x = 23.426, y = 69.862 e z = 20.716 para PI3K; x = 14.517, y = 23.348 e z = 20.742 para AMPK e x = 2.171, y = -2.280 e z = -19.403 para BRAF, todas centrado no ligante, foram construídas de modo a cobrir totalmente o sítio ativo das enzimas. Imediatamente depois os ligantes cristalográficos foram redocados com os seus receptores, de modo a validar a eficiência dos cálculos de ancoragem molecular (Figura 98).

(A) (B)

(C) (D)

Figura 99. Ligante redocado (amarelo) e ligante cristalográfico. (A) PI3K; (B) ERK2; (C) BRAF; (D) AMPK.

Em seguida, o noratiriol e o FR180204 compostos descritos na literatura com reconhecida atividade inibitória da proteína ERK2[252]foram superpostos ao sítio ativo da proteína utilizando o mesmo método descrito anteriormente. O mesmo foi feito para o Wortmanin e LY294002 inibidores de PI3K[253][254] e ainda com a Fenformina e HL010183 inibidores das proteínas AMPK e BRAF. [255][256]

É importante destacar que a estrutura química dos ligantes cristalográficos foi totalmente otimizado usando o método semi-empírico PM3 contido no pacote de

cálculos de orbitais moleculares do software Gaussian software 03. [257] Como resultado, obteve-se a superposição de todos os ligantes no centro ativo das respectivas proteínas ERK2, PI3K, AMPK e BRAF calculando a energia de interação ligante/receptor. Os mesmos procedimentos de cálculos de ancoragem molecular foram utilizados para a metformina e os adutos de Mannich sintetizados mais ativos 51, 52, 56, 57 e 58 (Tabela 10).

Tabela 10. Energias de interação ligante/receptor do Noratiriol, FR180204, LY294002, Wortmannim, Fenformina, HL010183, Metformina e dos compostos sintetizados mais potentes 51, 52, 56, 57 e 58 com as proteínas ERK2, PI3K, AMPK e BRAF.

Energia de ligação (Kcal/mol)

Ligante ERK2 PI3K AMPK BRAF

Noratiriol -8,1 - - - FR180204 -9,9 - - - LY294002 - -8,8 - - Wortmannim - -8,9 - - Fenformina - - -7,6 -6,5 HL010183 - - -8,0 -6,4 Metformina -4,5 -4,3 -4,8 -4,4 51 -8,1 -8,1 -6,7 -9,3 52 -7,8 -7,2 -6,6 -8,7 56 -7.8 -7.1 -6.4 -8.5 57 -6.4 -6.5 -5.9 -8.0 58 -7.9 -6.9 -6.4 -8.7

Os resultados de energia de ligação da metformina -4,5, -4,3, -4,8 e -4,4 Kcal/mol com as enzimas ERK2, PI3K, BRAF e AMPK, respectivamente, mostraram-se consideravelmente superiores aos obtidos para os inibidores destas proteínas (- 8,1 e -9,9 Kcal/mol - Noratiriol/ FR180204 para ERK2, respectivamente; -8,8 e -8,9 Kcal/mol -LY294002/Wortmannim para PI3K, respectivamente; -6,5 e - 6,4 Kcal/ mol - Fenformina e HL010183 para BRAF, respectivamente e -7,6 e -8,0 Kcal/mol - Fenformina e HL010183 para a AMPK, respectivamente). Estas diferenças nos valores de energia de interação indicam provavelmente que a bisguanidina não atua inibindo a proliferação celular das células de câncer através destes alvos terapêuticos, o que vem a corroborar com os mecanismos de ação antineoplásica deste composto descrito na literatura. [64]

Por sua vez, o aduto de Mannich 51 apresentou valores de energia de ligação ligante/receptor semelhante ou inferior aos inibidores descritos na literatura para todos os alvos proteicos testados indicando que este composto pode de fato atuar via mecanismos de ação múltiplos. Já para os compostos 52, 56, 57 e 58 as energias obtidas foram superiores as do Noratiriol, FR180204, LY294002 e Wortmannim nas proteínas ERK2 e PI3K, e ainda foram superiores as energias obtidas pela Fenformina e HL010183 para a AMPK. Já para proteína BRAF, a energia de ligação obtida foi inferior o da Fenformina e HL010183 (Tabela 10). Estes resultados indicam que o mecanismo de ação antineoplásica desses análogos da Metformina (52, 56, 57 e 58), possivelmente, não ocorre pela via de inibição da enzima PI3K, ERK2 e AMPK e ainda que a inibição da enzima BRAF seja um possível e provável alvo terapêutico. No entanto, investigações experimentais mais detalhados estão sendo realizadas no Laboratório de Pesquisa Clínica no Instituto Nacional do Câncer – INCA/RJ sob a coordenação da Dra. Cynthia Sternberg Intituto de Câncer (INCA) elucidar o mecanismo de ação dessas substâncias.

Os inibidores Noratiriol e FR180204 foram satisfatoriamente superpostos no sítio ativo da proteína ERK2 e apresentou uma importante ligação de hidrogênio e resíduo de aminoácido com a lisina 54 e importantes interações de van der Waals (verde) com diferentes resíduos de aminoácidos (Figura 99 e 100).

Figura 100. Conformação farmacofórica do Noratiriol (verde) com o sítio ativo da enzima

ERK2.

Figura 101. Conformação farmacofórica do FR180204 (verde) com o sítio ativo da enzima

ERK2.

No análogo da Metformina 51 pode-se destacar uma importante ligação de hidrogênio e o resíduo de aminoácido aspartato 964 da proteína ERK2 (Figura 101). Já o aduto de Mannich 52 apresentou também uma ligação de hidrogênio e resíduo de aminoácido asparagina 154 da proteína ERK2 (Figura 101). No composto 56 pode-se destacar a interação eletrostática entre um dos nitrogênios da molécula e o resíduo de aminoácido isoleucina 103 da proteína ERK2 (Figura 101). Outra interação importante deste composto é a ligação de hidrogênio e o resíduo de aminoácido glutamina 105 da proteína ERK2 (Figura 101). Ainda destacam-se importantes interações dos compostos 57 e 58 com resíduo de aminoácido da proteína ERK2. As demais interações representativas destes compostos são interações de van der Waals (verde) com diferentes resíduos de aminoácidos.

Composto 51

Composto 52

Composto 56

Composto 58

Figura 102. Interações do complexo ERK2 e os ligantes 51, 52, 56, 57 e 58.

Os inibidores LY294002 e Wortmannim foram satisfatoriamente superpostos no sítio ativo da proteína PI3K após ancoragem molecular e apresentou uma importante ligação de hidrogênio e resíduo de aminoácido com a Lisina 833. (Figura 103).

Figura 103. Conformação farmacofórica do LY294002 (verde) com o sítio ativo da enzima

Figura 104. Conformação farmacofórica do Wortmannim (verde) com o sítio ativo da enzima PI3K.

No análogo da Metformina 51 pode-se destacar uma importante ligação de hidrogênio e o resíduo de aminoácido aspartato 964 da proteína PI3K (Figura 104). Já o aduto de Mannich 56 apresentou também uma ligação de hidrogênio e resíduo de aminoácido Lisina 833 da proteína PI3K (Figura 104). Outra interação importante ocorre entre o composto 57 e o resíduo de aminoácido aspartato 950 da proteína PI3K (Figura 104).

Composto 51

Composto 52

Composto 56

Composto 58

Figura 105. Interações do complexo PI3K e os ligantes 51, 52, 56, 57 e 58.

O estudo de ancoragem molecular da proteína AMPK com a Fenformina mostrou ligações de hidrogênio com os aminoácidos Serina 334 e 226 e Aspartato 317 (Figura 105). Já com o inibidor HL010183 duas ligações de hidrogênios importantes com a Serina 314 e 226 foram detectadas (Figura 106).

Figura 106. Conformação farmacofórica do Fenformina (verde) com o sítio ativo da enzima AMPK.

Figura 107. Conformação farmacofórica do HL010183 (verde) com o sítio ativo da enzima AMPK.

No análogo da Metformina 51 destacam-se importantes ligações de hidrogênios e o resíduo de aminoácido aspartato 317 e serina 314 da proteína

AMPK (Figura 107).Já o aduto de Mannich 52 apresentou também uma ligação de

hidrogênio e resíduo de aminoácido serina 314 da proteína AMPK (Figura 107). No composto 56 pode-se destacar ainda uma ligação de hidrogênio e o resíduo de aminoácido serina 316 da proteína AMPK (Figura 107). Outra interação importante do composto 57 são as ligações de hidrogênio e o resíduo de aminoácido aspartato 317 e treonina 200 da proteína AMPK (Figura 107). Ainda destacam-se importantes interações dos compostos 58 são as ligações de hidrogênio e o resíduo de aminoácido serina 314 e serina 226 da proteína AMPK (Figura 107).

Composto 52

Composto 56

Composto 58

Figura 108. Interações do complexo AMPK e os ligantes 51, 52, 56, 57 e 58.

As interações intermoleculares que podem ser destacadas a partir da superposição da Fenformina com a proteína BRAF interações de Van de Waals com os aminoácidos isoleucina 659 e tirosina 656. Já o composto HL010183 apresentou interações similares com os resíduos de aminoácidos isoleucina 659 e asparagina 658.

Figura 109. Conformação farmacofórica da Fenformina (verde) com o sítio ativo da enzima BRAF.

Figura 110. Conformação farmacofórica do HL010183 (verde) com o sítio ativo da enzima

No análogo da Metformina 51 destacam-se interações com o resíduo de aminoácido isoleucina 659 e asparagina 658 da proteína BRAF (Figura 110). Já o aduto de Mannich 52 apresentou também interações com o resíduo de aminoácido isoleucina 659 da proteína BRAF (Figura 110). No composto 56 pode-se destacar ainda uma ligação de hidrogênio e o resíduo de aminoácido treonina 529 da proteína BRAF (Figura 110). Outra interação importante do composto 57 é a ligação de hidrogênio e o resíduo de aminoácido asparagina 581 da proteína BRAF e interações com o aspartato 594 (Figura 110). Ainda destaca-se uma importante interação do composto 58 da ligação de hidrogênio e o resíduo de aminoácido lisina 483 da proteína BRAF (Figura 110). Contudo, os adutos de Mannich sintetizados por sua vez apresentaram, via de regra, importantes interações com a proteína, refletindo numa melhor interação entre estes compostos e o alvo proteico.

Composto 51

Composto 56

Composto 57

Composto 58

5. CONCLUSÂO

Neste trabalho, descrevemos uma metodologia para a reação de Mannich multicomponente eficiente para a preparação de quinze adutos de Mannich estruturalmente semelhantes à metformina 50-64 derivados da ureia ou tioureia ou guanidina com rendimentos variando de 51-85%. As atividades antineoplásicas de todos os adutos de Mannich testados mostraram-se superiores as da metformina em todas as linhagens de câncer humano. Dentre todas as bases de Mannich, os compostos 56, 57 e 58 derivado da tioureia, ureia e guanidina e 2- piridinocarboxaldeído foram os mais potentes nas linhagens de câncer humano de ovário (ES2 e A2780) e pulmão (H460 e A549). Já são promissores candidatos a medicamentos para combater essas linhagens de câncer humano. Já o aduto de Mannich 51 derivado da tioureia e cinamaldeído, foi o composto mais potente mostrou-se mais efetivo na inibição da proliferação celular na linhagem celular do câncer de mama MDA-MB-231. Ainda, o adutto de Mannich 52 foi o mais potente na inibição da proliferação em MCF-7 do câncer de mama.

Estudos de ancoragem molecular indicaram também que o aduto 51, 52, 56, 56 e 58 além de ser o mais potente em diversas linhagens de câncer. Entretanto, o composto 51 mostrou-se capaz de inibir o crescimento das células neoplásicas mediante ação nas proteínas ERK2, PI3K, AMPK e BRAF importantes alvos terapêuticos envolvidos na proliferação celular. Desta forma, este composto mostra-se um protótipo promissor que pode vir a ser usado na quimioterapia do câncer. Já os outros adutos de Mannich mais potentes (52, 56, 57 e 58) demais adutos de Mannich, segundo os dados de ancoragem molecular deverão atuar somente nas proteínas AMPK e BRAF.