Expérimentation avec résazurine

A la suite des difficultés de maîtrise de la diffusion parasite de l’oxygène, nous avons utilisé un autre type de capteur, la résazurine, pour mesurer la DBO d’un échantillon d’eau. Celle-ci a la particularité de remplacer l’oxygène dans le cycle de respiration des bactéries. Cette molécule est réduite en un composé fluorescent, la résorufine, lors du processus de biodégradation de la matière organique. Il est donc aisé de suivre la concentration de la résorufine par la mesure de la fluorescence.

Nous verrons dans cette partie les résultats obtenus à l’aide d’un lecteur de fluorescence que nous avons développé, et les effets de quelques facteurs d’influence. Afin de vérifier l’hypothèse que nous avions évoquée lors des expériences avec les optodes, selon laquelle la variation de cinétique de consommation de l’oxygène en fonction de la dilution n’était pas due à la variation de la concentration en carbone organique, mais plutôt à cause d’autres molécules présentes dans le LB, nous avons utilisé ici du milieu M9 dont nous maitrisons complètement la composition. Toutes les expériences, présentées ci-après, ont été réalisées dans des puces de nouvelle génération d’une épaisseur de 500

µm.

4.1.4.1 Dégradation du milieu M9 à concentration en glucose contrôlée

La première expérience réalisée visait à observer l’effet de la variation de la concentration en carbone organique, et également à vérifier si elle joue un rôle sur la vitesse de dégradation. Pour cela, nous avions préparé le milieu M9 sans la source de carbone, nous pouvions alors faire varier la concen- tration de la source de carbone sans faire varier les autres éléments constituants le milieu. Plusieurs échantillons ont été préparés avec différentes concentrations en carbone organique. Les résultats obtenus ont été regroupés en figure 4.11. Nous pouvons constater que pour les cinq échantillons testés, il y a une variation temporelle de la fluorescence mesurée à travers les photodiodes.

200

150

100

50

0

Fluorescence mesurée par la photodiode (mV) 0 2 4 6 8 10 12 14

Temps (h) 0 mgC/L 10 mgC/L 20 mgC/L 30 mgC/L 50 mgC/L

FIGURE4.11 – Courbes de fluorescence au cours du temps de plusieurs échantillons à différentes concentrations en carbone organique.

Les courbes semblent s’accorder avec la croissance bactérienne. En effet, nous observons une première phase linéaire de l’augmentation de la fluorescence, qui correspond à la phase de croissance exponen- tielle des bactéries. Nous pouvons maintenant affirmer que la concentration en carbone organique n’intervient que faiblement sur la vitesse de dégradation des bactéries. Il vient ensuite une phase de ralentissement de la fluorescence, qui correspond à la disparition du carbone organique. Et finalement,

4.1. Principaux résultats expérimentaux

une phase de stabilisation du signal avec cependant une légère augmentation continue, qui peut s’expliquer par la dégradation de la lyse bactérienne et par l’épuisement de leur réserve nutritionnelle. Cet effet est d’autant plus marquant qu’il n’y a aucun nutriment pour l’échantillon témoin (courbe à 0 mgC/l). Finalement, nous pouvons constater que l’oxygène et sa diffusion dans la chambre ne perturbent pas la mesure.

4.1.4.2 Effet de la température sur l’activité bactérienne

Pour observer l’effet de la température d’incubation sur la croissance bactérienne, et l’effet induit sur la cinétique de fluorescence de la résorufine, nous avons réalisé deux expériences avec du milieu M9 à différentes concentrations en carbone organique. Une première expérience a été effectuée à température ambiante, soit 23°C, pendant 15 h. Puis, une seconde expérience a été effectuée à 30°C, pendant 15 h également. Dans les deux cas, un inoculum d’E. Coli à une concentration d’environ 8, 6.107cell/ml a été introduit dans les échantillons. En accord avec les mécanismes déjà connus de la croissance bactérienne, la figure 4.12 montre bien l’effet de la température d’incubation sur la vitesse de dégradation des matières organiques.

140 120 100 80 60 40 20 0 Fluorescence à 23 °C 14 12 10 8 6 4 2 0 Temps (h) 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Fluorescence à 30 °C 0 mgC/L à 23°C 10 mgC/L à 23°C 20 mgC/L à 23°C 40 mgC/L à 23°C 50 mgC/L à 23°C 0 mgC/L à 30°C 5 mgC/L à 30°C 10 mgC/L à 30°C 20 mgC/L à 30°C

Fluorescence mesurée par les photodiodes (mV)

FIGURE4.12 – Graphique montrant l’effet de la température d’incubation sur la cinétique de fluores-

cence provenant de puits incubés à 8, 6.107cell/ml bactéries.

En effet, le métabolisme des bactéries fonctionne plus ou moins rapidement selon la souche bacté- rienne. Pour notre expérience, la souche utilisée était E. Coli, sa température optimale de croissance est de 37°C. Les résultats obtenus sont donc correct vis-à-vis de la souche utilisée. A 23°C, les bactéries se développent lentement, si bien qu’au bout de 15h de mesure, les courbes ne se stabilisent pas encore, cela signifie que le carbone organique n’est pas encore totalement dégradé. Par contre, à 30°C, les bactéries se développent plus rapidement, et au bout de 9h de mesure, il ne semble plus y avoir

d’évolution significative de la fluorescence, le carbone organique étant alors complètement dégradé.

4.1.4.3 Influence des paramètres optiques sur la mesure

Lors des premières expériences avec la résazurine, le lecteur de fluorescence n’était pas équipé de filtre optique d’excitation, seulement de filtre d’émission de moindre qualité (filtre A). Le spectre de transmission du filtre était largement décalé par rapport au pic d’émission de la résorufine, mais tout en étant dans la gamme spectrale d’émission de la fluorescence, afin que la lumière des LED ne soit pas transmise à la photodiode.

100 80 60 40 20 0 Intensité relative (%) 700 600 500 400 300 Longueur d'onde (nm) absorbance résorufine émission résorufine spectre émis par les DELs lumière reçue par la photodiode

au travers le filtre A

FIGURE4.13 – Courbe représentant le spectre d’émission des LEDs et le spectre détecté par les photo- diodes au travers le filtre A.

La transmittance optique de ces filtres était de 50%, ce qui est peu. En effet, la moitié des photons émis sont absorbés par le filtre, la plage de tension alors fournie par la photodiode est faible. La résolution du DaqMx (convertisseur analogique/numérique) étant liée à la plage de tension de mesure, plus la plage est faible plus la résolution de la conversion l’est également. Afin d’améliorer la résolution de conversion, nous avons remplacé les filtres A par des filtres de très bonne qualité (filtre B), et rajouté des filtres d’excitation, pour avoir une plage de tension mesurable plus grande. Les spectres théoriques de transmission de ces deux filtres sont proches mais ne se recouvrent pas. De plus, leur transmittance théorique est de l’ordre de 99%.

Nous avons alors effectué une comparaison, par expérimentation, des deux filtres. Nous avons, pour cela, préparé quatre échantillons de milieu M9 avec différentes concentrations en carbone orga- nique. Les résultats regroupés en figure 4.14 montrent que les courbes suivent globalement la même dynamique quel que soit le filtre utilisé.

Nous remarquons, par ailleurs, que l’intensité lumineuse mesurée par les photodiodes est 10 fois plus importante avec les filtres B qu’avec le filtre A. Ce gain permet d’obtenir une plus grande résolution de

4.2. Évaluation de la charge carbonée par une approche théorique