Conception et dimensionnement de la version « micro » : la bio-puce

La miniaturisation du système de mesure de la DBO a pour intérêt principal l’augmentation du nombre de points de test afin de pouvoir réaliser plusieurs mesures simultanées dans un appareil plus petit. Pour cela, il est nécessaire de réduire le volume des échantillons à tester.

2.4. Systèmes fluidiques « macro » et « micro »

Nous allons donc présenter, dans cette partie, les deux générations de puces que nous avons réalisées. La première a été conçue et fabriquée en vue de mesurer l’oxygène dissous avec un système à base d’optode. Les expériences ont montré un défaut de remplissage pour cette génération de puce. En effet, des bulles d’air sont apparues lors des tests. Nous avons alors développé une seconde génération de puce, d’une part pour pallier à ce défaut, et d’autre part pour introduire un nouveau type de capteur à base de résazurine.

2.4.2.1 Les contraintes de conception des biopuces

La lecture du cahier des charges du projet permet de mettre en évidence certaines contraintes liées essentiellement au capteur, aux bactéries et à la partie fluidique.

2.4.2.1.a Contraintes liées aux bactéries

Dans le cadre de ce projet, il a été établi que plusieurs souches bactériennes doivent être intégrées au biocapteur. Cela nous amène à définir des points qui peuvent être bloquants pour la réalisation des puces microfluidiques. Le premier que nous allons aborder concerne la méthode de stockage des bactéries ainsi que leur mode de conservation. En effet, un stockage sur puce microfluidique impose d’avoir des procédés de fabrication compatibles avec le domaine de viabilité des bactéries (température, endommagement des bactéries lors de la fabrication,...) et la méthode de conservation. L’analyse des différents procédés nous a donc amené à envisager une préparation et un stockage des bactéries à l’extérieur du système, puis une injection à l’intérieur de l’appareil de mesure. Afin d’être dans les mêmes conditions que la mesure de DBO5, les bactéries devront être en suspension dans la

solution.

Un autre point pouvant être critique pour la mesure de la DBO est le maintien en activité des bactéries. En effet, une diminution de la population peut entraîner des biais importants dans les mesures. Le matériau doit donc être biocompatible et structurable par les technologies microsystèmes. Plusieurs options se présentent à nous, tels que le PDMS, la SU8, les thermoplastiques. Le matériau sera choisi en fonction de ses caractéristiques, vis à vis du capteur à utiliser, et de sa porosité à l’oxygène.

2.4.2.1.b Contraintes liées au capteur

La mesure de DBO impose un contact entre la sonde et le milieu. Elle peut se réaliser soit par élec- trochimie, en utilisant par exemple des sondes de Hersh ou des sondes de Clark, soit par mesure de fluorescence, en utilisant des optodes ou un fluorophore, tel que la résazurine. Dans les deux cas, elle nécessite l’intégration d’un capteur au cœur de la puce microfluidique. Pour cela, les capteurs devront être, soit à faibles coûts et compatibles avec les procédés de fabrication afin d’être jetables ;

soit réutilisables et facilement intégrables. L’ensemble de ces paramètres rendent difficile l’utilisation d’un seul capteur pour réaliser la mesure sur un nombre important de puits. Les méthodes de mesure proposées imposent un milieu transparent aux longueurs d’ondes utiles pour la mesure optique de la DBO.

2.4.2.1.c Contraintes liées à la partie fluidique

Dans le cas des puits de dimension micrométrique, l’une de leurs principales difficultés réside dans leur remplissage sans bulle d’air. Pour les alimenter, il est nécessaire d’utiliser des canalisations intégrées dont la section et la longueur seront des paramètres clés. En effet, ils conditionneront non seulement le débit des fluides mais également les dimensions des particules qui vont y circuler. Pour ces dernières, le cahier des charges impose un diamètre de 20µm, ce qui implique des canalisations avec une hauteur

de 100µm minimum.

Actuellement, concernant les éléments extérieurs d’actionnement fluidique, aucune contrainte n’a été définie car leur choix dépendra surtout des dimensions de la partie fluidique. Nous souhaitons, tout de même, que la connexion entre les puces et l’extérieur soit standardisée afin qu’il n’y ait aucune incertitude sur les mesures pouvant venir de cette partie.

Pour la mise en écoulement des fluides, plusieurs options sont envisageables parmi lesquelles des pompes piézoélectriques, des pompes péristaltiques ou bien des générateurs de pression. En vue d’une intégration système poussée, il y aura aussi possibilité d’intégrer des vannes ou des switch directement sur la puce, afin de diminuer au maximum les volumes morts et les longueurs de canalisation.

A la lecture de ces contraintes, nous voyons bien que de nombreux points restent à éclaircir avant la réalisation du premier prototype complet. Il paraît nécessaire de vérifier que les systèmes micro- fluidiques réalisent des mesures comparables aux dispositifs actuellement utilisés. Pour cela, nous proposons de réaliser un dispositif simple ne contenant qu’un seul puits de mesure. Ce dispositif doit nous permettre de définir des protocoles de fabrication, de remplissage et de mesure dans les puits. Nous allons, dans un premier temps, nous intéresser à l’intégration des optodes, qui seront pilotées à l’aide d’une fibre optique. Nous nous intéresserons ensuite à l’intégration de la résazurine dans les puces, ce qui nous amènera à modifier ou compléter leur conception.

En pratique, afin de mettre en œuvre rapidement ce dispositif, nous envisageons d’utiliser du Po- lyDiMéthylSiloxane (PDMS) car cette technologie est très largement utilisée pour le prototypage rapide.

2.4. Systèmes fluidiques « macro » et « micro »

2.4.2.2 Première génération de puce

Afin de faciliter la réalisation de la puce, nous avons décomposé l’approche en deux parties : la première sera dédiée à la réalisation des réservoirs, et la seconde concernera le capot sur lequel l’optode sera placée et qui permettra de fermer les puits.

L’optode que nous allons utiliser est circulaire de diamètre 5 mm et d’épaisseur 150µm. Cela nous impose des puits de dimensions comparables, nous avons donc fait le choix d’utiliser des puits circulaires dont le diamètre minimal est de 7 mm afin de pouvoir aisément aligner le capot avec l’optode et le puits. Nous avons décidé de réaliser des réservoirs d’une hauteur de 500µm afin d’obtenir un volume d’environ 20µl. Pour les canalisations d’entrée et de sortie, nous avons choisi une section de 500x500µm2, d’une part pour permettre le passage de particules de 20µm de diamètre en suspension et d’autre part, pour des raisons de simplification de fabrication. En effet, ainsi nous n’avons besoin que d’un seul niveau de canalisation. Pour des questions d’encombrement et de réalisation des supports, nous avons fait le choix de prendre une longueur de 6 mm. Le dessin de cette puce est représenté sur la figure 2.15. 250 µm 7 mm 6 mm (1) (2) (2) _{(3) (3)} 28 mm 14 mm (a) (b) (c) (d)

FIGURE2.15 – Schémas représentant la puce microfluidique en 2D (a) et en 3D (b), et du capot de la puce en 2D (c) et en 3D (d). La puce microfluidique ((a) et (b)) se compose du réservoir de mesure (1), d’une entrée et d’une sortie (2) et de deux canalisations (3). Le capot ((c) et (d)) se compose d’un emplacement incrusté (4) pour accueillir l’optode (5) et de l’entrée et sortie fluidique (2)

couche de résine d’épaisseur légèrement supérieure à celle de l’optode sera déposée sur le capot (Figure 2.16). Un emplacement pour l’optode sera réalisé dans ce polymère pour y intégrer le capteur. Les connexions fluidiques vers le réservoir seront réalisées au travers du capot (Figure 2.15 (c) et (d)).

(1) (2)

(4) (3)

FIGURE2.16 – Schéma représentant une vue en coupe du capot. (1) lame de verre, (2) la résine, (3)

l’optode et (4) les entrées et sorties fluidiques.

Lors des premiers tests, nous avons eu quelques difficultés à remplir correctement la puce sans bulle d’air. En effet, la tension de surface aux parois tire le fluide plus rapidement qu’au centre du puits, et la circularité de celui-ci amène donc le fluide en sortie en se refermant sur lui-même et en emprisonnant ainsi une bulle d’air. Nous avons alors conçu une deuxième génération de puces, afin de faciliter leur remplissage.

2.4.2.3 L’amélioration de la puce : deuxième génération

Comme nous venons de le voir avec la première génération de puces, la difficulté de remplissage du puits était due à sa géométrie.

Nous avons donc donné une forme ovale au réservoir. Ainsi, sur sa longueur et grâce au champ de vitesse du fluide qui est plus important en son centre, le front du fluide peut se stabiliser et avancer à la même vitesse. Afin d’avoir toujours un volume d’environ 20µl, l’épaisseur du réservoir reste inchangée, et nous avons alors fixé la longueur du réservoir à 8 mm et la largeur à 6 mm. Dans le but de standardiser le procédé de fabrication tout en augmentant le nombre de mesures possibles par puce, nous les avons conçues pour qu’elles puissent s’adapter aux lames de verre de microscope de taille standard (76×26 mm2). Ainsi, sur une seule puce nous pouvons placer 8 réservoirs comme on peut le voir sur le dessin de cette nouvelle puce représentée sur la figure 2.17.

74 mm

24 mm

8 mm

6 mm