Chapitre II La spectrométrie de masse
III) Expériences de fragmentation par spectrométrie de masse
Comme décrit dans le chapitre précèdent, il est possible d’isoler une espèce ionique, de la fragmenter en augmentant son énergie interne et de détecter les ions « fils » générés. Ce procédé est appelé spectrométrie de masse en tandem ou MS/MS. Suivant les appareils utilisés, on distingue deux types de MS/MS :
− la MS/MS « spatiale » : plusieurs analyseurs de masse sont couplés (cas du triple
quadripôle API III+) ; le premier (MS1) sert à la sélection de l’ion précurseur ou parent,
le second va être utilisé comme cellule de collision et le dernier (MS2) va permettre
d’analyser les fragments générés. Dans ce cas de figure, le nombre de MSn, avec n =
nombre d’expériences, est directement lié à la quantité d’analyseurs couplés ;
− la MS/MS « temporelle » : dans ce cas, un seul analyseur est utilisé et l’ensemble des opérations (isolation, fragmentation et analyse) se déroule au même endroit à des intervalles de temps spécifiques. Les ions générés par dissociation peuvent à leur tour subir une étape d’isolation, de fragmentation et ainsi de suite ce qui donne accès à la
MSn. Ce type de MS/MS se rencontre au niveau des trappes ioniques (Louris et al., 1990)
et des analyseurs à résonance cyclotronique.
Toutes les expériences de fragmentation réalisées au cours de ce travail ont été menées sur la trappe ionique. Cet analyseur offre deux avantages en mode MS/MS. Premièrement, la trappe ionique fonctionne en mode pulsé ce qui lui permet d’accumuler au cours du temps les ions de
m/z à fragmenter. Dans ces conditions, le rapport signal sur bruit peut être maintenu constant
au cours de l’expérience. Deuxièmement, la trappe permet d’accéder aux voies de fragmentation de faibles énergies. Il est cependant possible d’accéder à des voies de fragmentation de plus hautes énergies d’activation en alternant successivement les périodes d’excitation par résonance et de refroidissement énergétique par collisions. Etant donné que
l’Ei diminue moins rapidement que l’Ec lors du refroidissement, la quantité d’Ei s’accumule
progressivement au cours des excitations successives jusqu’à atteindre plusieurs eV (March, 2000). Dans cette partie, deux points seront abordés : d’une part le principe général de la fragmentation par collision et d’autre part l’application de ce procédé à la réalisation de cartes peptidiques.
ces collisions, supposées inélastiques, l’ion (M+) voit son énergie interne augmenter jusqu’à
sa dissociation en fragments F+ et en espèces neutres (N) :
N F M
G
M+ + activation→ +* dissociation→ + +
avec G le gaz de collision et M+* l’ion dans un état excité. La transformation d’énergie
cinétique en énergie interne (vibrationnelle et/ou électronique) fait passer le niveau énergétique de l’ion de E à E + Q ce qui lui permet de franchir la barrière d’énergie
d’activation E0. Lors de l’étape de dissociation, l’excès d’énergie interne est en partie perdu
sous la forme d’énergie cinétique (Figure 36).
Figure 36 : Chemin réactionnel du procédé de dissociation par collision. Sous l’effet des collisions répétées avec les atomes de gaz neutre, l’énergie interne initiale de l’ion M+ (E) passe au niveau M + Q ce qui lui permet de passer la barrière énergétique d’activation E0 et de se fragmenter. Au cours de la dissociation, l’excès d’énergie interne est perdu sous forme d’énergie cinétique (T).
L’énergie cinétique qui peut être transformée en énergie interne est dite de centre de masse
(Et), et se calcule au moyen de l’équation suivante :
M m m E Et c + =
avec m la masse du gaz de collision, M la masse de l’ion et Ec son énergie cinétique dans le
référentiel considéré (De Hoffmann et al., 1994). D’après cette équation, plus la masse de
E E0 : énergie d’activation Q : apport énergétique E n er gi e Coordonnées de la réaction
ENERGIE INTERNE TOTALE
M+
M+* T
l’ion à fragmenter est importante, plus l’énergie de centre de masse diminue et donc l’efficacité des collisions. Il est toutefois possible d’améliorer le rendement des collisions en augmentant la masse du gaz jusqu’à un certain point. En effet, plus la taille du gaz est augmentée, plus les dispersions angulaires des ions fragments seront élevées ce qui est défavorable à leur focalisation (et donc leur détection). Ainsi les gaz les plus utilisés sont l’hélium, l’argon voire le xénon. Au niveau de la trappe ionique ESQUIRE 3000+ utilisée lors des expériences de fragmentation, le gaz de collision présent dans l’analyseur est de l’hélium
à une pression de ~ 4.10-6 mbar.
3.2) Application : réalisation de cartes peptidiques
Dans le cas de notre étude, les expériences de fragmentation au sein de la trappe ionique ont été réalisées afin d’obtenir la carte peptidique d’Eg5 et de CENP-E après digestion enzymatique par une protéase aspécifique. Les régimes de collisions au sein de la
trappe sont de basse énergie ce qui implique que l’Ec de l’ion précurseur est inférieure au keV.
Cette donnée énergétique nous informe sur les mécanismes possibles de dissociation des peptides. La nomenclature proposée par Roepstorff et Folhman puis complétée par Biemann permet de caractériser les différents fragments susceptibles d’être générés après rupture d’une ou deux liaisons peptidiques (Roepstorff et Fohlman, 1984 ; Biemann, 1988). Lorsque la
charge est portée par la partie N-terminale du fragment, les ions sont de type an, bn et cn ou n
représente le nombre d’acide aminé ; lorsque la charge est présente du coté C-terminale on
parle alors d’ions de type xn, yn et zn (Figure 37). Cette nomenclature tient également compte
de la nature de la liaison clivée. La rupture de la liaison peptidique peut s’effectuer à trois
niveaux distincts : entre Cα – C (ions an et xn), entre C – N (ions bn et yn ) et entre N – Cα à
l’origine des ions cn et zn. On distingue également deux autres types de fragments qui résultent
du clivage d’au moins deux liaisons peptidiques internes à la chaîne polypeptidique. Le premier type est appelé fragment interne car ce dernier à perdu simultanément les parties N et C-terminales initiales (Figure 37). Les fragments internes sont en général produits par un double clivage de type b et y (on parle alors d’ion amino-acylium). Néanmoins, ces derniers peuvent également être formés par un double clivage de type a et y ; dans ce cas de figure le fragment interne généré est de type amino-immonium. Le second type de fragment est appelé ion immonium. Ces ions, qui résultent de clivages multiples du polypeptidique, ne contiennent qu’une seule chaîne latérale (Figure 37).
Ces voies de fragmentation vont ainsi permettre de déterminer la séquence en acides aminés du peptide en analysant les différences de masse des ions consécutifs provenant de sa fragmentation par collisions.
Figure 37 : Principales voies de fragmentation par CID des peptides proposées par Roepstorff et Fohlmann. Lorsque la charge est retenue par la partie N-terminale, les ions obtenus sont notés an, bn et cn ; lorsque cette dernière est du coté C-terminal, les ions sont appelés xn, yn et zn. La dénomination des ions tient compte de la nature de la liaison clivée. La rupture d’au moins deux liaisons peptidiques donnent naissance à deux fragments supplémentaires en faible abondance : les fragments internes et les ions immoniums
(http://www.matrixscience.com/help/fragmentation_help.html).
a2 b2 c2
z2
y2
x2