3.1 Evaluation de la pathogénie des isolats de F oxysporum in planta

L’estimation du pouvoir pathogène des différentes souches est réalisée sur des plantules de tomate au stade de quatre vraies feuilles. Les plantules (de deux à trois semaines) sont déterrées et les racines lavées sous l’eau de robinet puis rincées à l’eau distillée stérile. Les racines de 5 plantules par isolat sont trempés dans une suspension de spore, préparée à partir de chacun des isolats, pendant 30 minutes. Les plantules inoculées sont immédiatement remis dans des pots remplis de sol de jardin mélangé à la tourbe stérile (Fig. V.2). Les témoins sont trempés dans l’eau distillée stérile pendant le même temps. L’estimation du pouvoir de pathogénie est ensuite vérifiée par l’estimation des symptômes externes de la fusariose selon le barème de Douira et Lahlou (1989) ci-dessous par le calcul de l’indice d’altération foliaire:

Tableau V.1. Echelle d’évaluation de l’altération foliaire selon Douira et Lahlou (1989) Note Apparence des feuilles

0 Feuilles d’apparence saines

1 Feuilles cotylédonaires : flétrissement ou jaunissement 2 Feuilles cotylédonaires : chute

3 Feuilles vraies : flétrissement ou jaunissement 4 Feuilles vraies : nécrose

69 Les notes rapportées au nombre de feuilles constituent l’indice d’altération foliaire (IAF), calculé selon la formule ci-dessous. Un indice moyen est ensuite calculé pour chaque lot de plantes.

Afin de vérifier l’incrimination des différents isolats du FOL dans l’infection des plantes de tomates, le ré-isolement de l’espèce fongique est réalisé selon la méthode de Rappilly et al. (1968) décrite précédemment et qui consiste à déposer sur la surface du milieu PDA en boite de Pétri, de petits fragments de racines, préalablement désinfectés à l’eau de javel à 12%, des plantules de tomate infectées et saines suivi d’une incubation pendant 7 jours. La nature des agents microbiens cultivés est par la suite déterminée.

Le champignon est ensuite conservé dans des tubes à essais à une température de 4°C, pour une utilisation ultérieure. Le repiquage des isolats est répété chaque période de 2 à 3 mois.

Chapitre V : Matériel et méthodes

70 Figure V.2. Dispositif expérimental pour l’étude de la pathogénie des isolats fongiques

Culture monospore de l’agent pathogène 10 jours d’incubation

Inondation à l’eau distillée stérile

et grattage de la culture

Désinfection et germination des graines de tomate (3jours)

Repiquage dans des pots contenant un mélange terre de jardin + terreau

(3 :1)

Filtration de la suspension (spore+mycélium)

Déterrement des plantules et rinçage des racines

(eau robinet et eau distillée stérile)

Ajustement de la concentration de l’inoculum (107

spore/ml

Trempage des racines bléssées dans la suspension sporale (30mn)

Repiquage des plantules dans des pots (sol +terreau stérile)

Estimation de I.A.F

Culture des plantules jusqu’au Stade 4 feuilles

71 V.3. Etude de l’activité antagoniste in vitro des isolats bactériens vis-à-vis de F. oxysporum f. sp lycopersici

V.3.1. production des substances diffusibles (Antibiose)

La capacité de la totalité des souches bactériennes isolées à inhiber la croissance du champignon pathogène par la production de substances diffusibles a été testée par la méthode de confrontation directe (dual assay) en boite de Pétri sur le milieu PDA selon la méthode décrite par Inam-UL-Haq et al. (2003). La souche bactérienne est inoculée en trait au bord de la boite à l’aide d’une anse stérile. Après incubation à 30°C à l’obscurité pendant 48h, une pastille mycélienne de 5 mm de diamètre, prélevée au bord d’une jeune colonie fongique âgée d’une semaine, est déposée au centre de la boite à environ 2.5 cm de la souche antagoniste testée. L’incubation des boites est effectuée à 25°C et à l’obscurité pendant 7 jours (Pour chaque essai, le dispositif expérimental est répété deux fois).

Lecture des résultats

Des mesures du rayon des colonies sont effectuées après 7 jours d’incubation. L’inhibition de la croissance fongique a été évaluée par le calcul du pourcentage de réduction de la croissance mycélienne selonla formule suivante (Whipps, 1987).

I% = (R1-R2) / R1×100

R1 = distance radiale (en mm) de la croissance mycélienne en absence de la souche antagoniste (contrôle)

R2 = distance (en mm) de la croissance mycélienne en direction de l’inoculation bactérienne.

V.3.2. Production des substances volatiles et l’acide cyanhydrique (HCN) V.3.2.1. Test de la production des substances volatile

100 µl d’une suspension de chaque bactérie testée sont déposés au centre d’une boite de Pétri contenant le milieu LB et KB puis étalés sur la surface, parallèlement, une pastille de 5 mm de diamètre du champion (FOL) est déposé au centre d’une boite contenant le milieu PDA. Les couvercles des deux boites sont enlevés et les deux fonds sont scellés à l’aide d’une bande de Parafilm afin d’éviter les pertes des substances volatiles. L’ensemble est incubé pendant 5 à 7 jours à 28°C. Une boite de Pétri servant de témoin contenant uniquement le milieu PDA est ensemencée par l’agent pathogène (Montelegre et al. 2003).

L’inhibition de la croissance mycélienne a été évaluée par le calcul du pourcentage de réduction de la croissance mycélienne selon la formule de whipps (1987).

Chapitre V : Matériel et méthodes

72 La capacité des isolats bactériens pré - sélectionnés à ralentir la croissance de l’agent pathogène par les substances volatiles a été évaluée par la mise en évidence des souches à produire de l’acide cyanhydrique selon la méthode de Bakker et Schippers (1987). Cette dernière consiste à ensemencer chaque souche bactérienne par stries à l'aide d'une anse stérile à la surface du milieu de Bakker et Schippers (Annexe I). Sur le couvercle de chaque boîte ensemencée est déposé un papier filtre stérile imprégné d'une solution de 0.5% d'acide picrique dans une solution de 20% de carbonate de sodium (de couleur jaunâtre). Les boîtes sont ensuite scellées à l’aide d’un Parafilm et gardées en position normale (non inversée) dans une étuve à 28°C pendant 3 jours. Le changement de couleur du papier filtre du jaune au brun indique la production d'HCN.