Evaluation de l’efficacité in vivo de l’association RFA et Gel-GM-CSF-PPD

Afin d’évaluer l’effet de l’association in vivo de la RFA et de l’hydrogel contenant le GM-CSF et le PPD, nous avons traité des souris Balb/c porteuses de tumeurs CT26 par la RFA suivi d’une injection intratumorale de Gel-GM-CSF-PPD. Des tumeurs secondaires ont ensuite été implantées à distance de la tumeur primaire. La croissance tumorale a été évaluée par imagerie de bioluminescence selon le protocole décrit dans l’article 2. Les résultats obtenus ont montré une régression des tumeurs chez 50% des souris traitées par la combinaison RFA + Gel-GM-CSF-PPD, contrairement à la combinaison RFA+ Gel-GM-CSF-BCG qui induit une régression complète des tumeurs chez tous les animaux traités (Figure 24).

Figure 24 Suivi de croissance des tumeurs secondaires par imagerie de Bioluminescence. (A) croissance des tumeurs secondaires après traitement par RFA + Gel-GM-CSF-BCG (courbe noire) et RFA + Gel-GM-CSF-PPD (courbe rouge) (n=4, Mean ± SD). (B) Exemple de souris répondeuse au traitement RFA + Gel-GM-CSF-PPD (à gauche) et d’une souris non répondeuse (à droite).

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 _Controle PPD 1µg PPD 5µg IF N -y ( p g /m l)

153 2. Méthode d’analyse de l’infiltrat lymphocytaire

Nous avons travaillé dans le cadre d’une collaboration sur la validation d’une nouvelle méthode de quantification de l’infiltrat lymphocytaire dans les tumeurs colorectales qui permettrait une meilleure évaluation de celui-ci en fonction de la réponse à l’immunothérapie.

2.1 Etat de l’art

L’infiltrat lymphocytaire (TILs) est une valeur pronostic dans le CCR. Dans les premières études, il était évalué uniquement par un pathologiste qui comptait les lymphocytes dans une zone limitée de la tumeur au microscope. Cette méthode était sujette aux erreurs et la reproductibilité des résultats était très faible. Plus récemment, une équipe a développé une méthode de quantification des TILs grâce à des tissus microarrays (TMA) (J. Galon 2006). Cette méthode permet d’évaluer de manière plus fiable que la classification TNM le pronostic des malades (Jérôme Galon et al. 2014). Les approches utilisant les TMA sont peu couteuses et pertinentes mais la zone analysée est limitée à la taille de cette dernière. De plus, la distribution des lymphocytes dans la zone tumorale est hétérogène et le comptage des TILs uniquement dans des zones limitées de la tumeur biaise forcément les résultats.

Afin de s’affranchir de ces limites, notre équipe a développé une méthode semi-standardisée pour la quantification linéaire de l’infiltrat lymphocytaire (LQLI) basée sur l’analyse de grandes zones tissulaires incluant le tissu tumoral, le front tumoral et la région adjacente (Allard et al. 2012). Les profils de TILs obtenus ont été corrélés à la survie des patients atteints de CCR. Cette méthode a été validée dans le cadre d’une étude prospective sur 1220 patients atteints de CCR de stade III traités par chimiothérapie adjuvante (Emile et al. 2017).

2.2 La méthode la LQLI et ses limites

L’analyse des TILs avec la méthode LQLI est implémentée par un logiciel nommé Visilog® dont les paramètres sont non modulables. En effet, la détection des lymphocytes est réalisée sur des critères de taille et de couleurs qui varient en fonction du marqueur utilisé. La quantification des lymphocytes d’une région d’intérêt (ROI) de 4 millimètres (1 mmx 4 mm)

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est possible par la pose d’un patch non modifiable et qui requiert une délimitation manuelle du front tumoral. Les lymphocytes sont ensuite comptés en fonction de leurs distances du front tumoral supposé droit dans cette méthode. La Figure 25 représente la disposition des patchs sur le front tumoral et la courbe de quantification des lymphocytes générée par le logiciel Visilog®. Bien que robuste et reproductible, cet outil est malheureusement peu adapté aux les tumeurs millimétriques et dans le cadre d’étude préclinique.

Figure 25 Méthode de la LQLI appliquée sur coupe de tumeurs colorectale chez l’homme (Allard et al. 2012).

2.3 Nouvelle méthodologie pour la quantification des lymphocytes.

Pour faire face aux limites de Visilog®, nous avons proposé, en collaboration avec l’équipe Systèmes Intelligents de Perception (SIP) du Laboratoire d’Informatique de Paris Descartes, de mettre en place une nouvelle méthodologie pour quantifier l’infiltration lymphocytaire dans une zone tumorale à partir d’images histologiques. Cette méthodologie repose sur cinq différentes étapes (Djiro, Kurtz, et Loménie 2018) (Figure 26). Son objectif est de fournir en sortie une courbe de quantification de l’infiltration lymphocytaire à partir d’une image fournie en entrée.

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Figure 26 Illustration des différentes étapes de la nouvelle méthodologie proposée pour la quantification de l’infiltrat lymphocytaire.

Les lames d’immunohistochimie scannées sont chargées sur une plateforme web qui permet leur stockage et la réalisation d’annotation du front tumoral et des ROIs par les anatomopathologistes de notre laboratoire (étape 1). Les ROIs sont ensuite récupérés par l’équipe de bio- informaticiens qui réalise le traitement de l’image. Il s’en suit une séparation des marqueurs (hématoxyline et Diaminobenzidine) sur la base de la teinte, de la saturation et de la luminance (étape 2). Un exemple de séparation des marqueurs effectuée par le logiciel est illustrée Figure 27.

Figure 27 Illustration de la séparation du marqueur Diaminobenzidine (DAB) et Hématoxyline.(A) image originale ; (B) DAB extraite ; (C) Hématoxyline extraite.

Après cette étape de segmentation, les images obtenues en niveau de gris représentent un mélange de lymphocytes et de fibrose. Ainsi une étape supplémentaire de séparation par seuillage dynamique est appliquée afin d’éliminer les zones de fibrose dans la ROI (étape 3, Figure 28).

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Figure 28 : Elimination du bruit de fond du à la fibrose dans la zone d’intérêt.(A)Transformation de l’image en niveau de gris après segmentation des marqueurs hématoxyline et DAB, (B) image obtenue après binarisation d’Otsu, (C) image obtenue pour la détection des lymphocytes (Djirot.2018).

Enfin, la quantification de l’infiltration lymphocytaire est réalisée dans la zone d’intérêt selon une carte qui permet de déterminer la distance de chaque pixel par rapport à la frontière tumorale préalablement annotée (étape 4). L’idée est de pouvoir quantifier de manière fine l’invasion lymphocytaire en prenant en compte l’éloignement de ceux-ci par rapport au front tumoral et cela, grâce à la réalisation d’iso-courbes à la frontière tumorale d’inter-distance paramétrable. Ainsi, des courbes de quantification de l’infiltrat lymphocytaire seront générées (Figure 29).

Figure 29 : Obtention de l’infiltration lymphocytaire à partir des Iso-courbes générées. (A) Iso-courbes obtenues (Zone rouge) ; (B) iso-courbes distantes de 5 µm du front tumoral (bleu) vers l’intérieur de la tumeur, (1) première zone 40% et deuxième 60% du lymphocytes (de l’extérieur vers le centre de la tumeur), (2) première zone 20 %, deuxième 60% du lymphocytes et troisième 20%. Le lymphocyte sera compté dans la zone ou le pourcentage est le plus grand. (C). Courbe résultante de la quantification des lymphocytes.

2.4 Validation de la méthode mise en place

La méthode mise en place a été validée sur des échantillons de patients. En effet, les profils d’infiltration lymphocytaire obtenus avec le logiciel Visilog® ont été comparés à la nouvelle

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méthode mise en place. Pour cela, il était nécessaire de comparer les 2 techniques en utilisant les mêmes zones de calculs. C’est pourquoi, l’analyse a été réalisée sur des ROI placées aux mêmes endroits avec les deux méthodes et les résultats issus de celles-ci ont été contrôles (Figure 30). Après comparaison des profils obtenus, plus de lymphocytes sont détectés au niveau du front tumoral avec la nouvelle méthode. Cependant, les analyses issues du logiciel Visilog® sont classées en 4 profils, notre méthode permet le classement correct de ceux-ci. Ainsi, nous pouvons valider cette nouvelle méthode pour l’analyse des échantillons de tumeurs colorectales humaines et murines.

Figure 30 : Comparaison des profils d’infiltration lymphocytaire obtenus avec Visilog (à droite) et la nouvelle méthodologie mise en place (à gauche).

3. Application à un modèle tumoral plus pertinent

Le microenvironnement tumoral joue un rôle important dans la croissance des tumeurs et la réponse au traitement (Spano et Zollo 2012). En effet, le microenvironnement contient, en plus des cellules tumorales, plusieurs types de cellules formant le stroma, en particulier les cellules immunitaires. Ainsi, les Treg, les MDSCs et les macrophages du stroma peuvent sécréter des facteurs immunosuppresseurs tels que le TGF-β et l’IL-10 qui favorisent la croissance tumorale et inhibent la réponse immunitaire antitumorale (Shevach 2011).

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Une des principales approches pour étudier l'immunologie tumorale et l'immunothérapie utilise les greffes de cellules tumorales murines in vivo. En effet, les lignées tumorales sont dérivées de tumeurs de souris immunocompétentes et sont caractérisées par une croissance rapide après injection et une relative reproductibilité. Une étude a montré qu’en fonction du site d’implantation de la tumeur le microenvironnement tumoral et la réponse au traitement pouvaient être modifiés (Wilmanns et al. 1992) ; (Pocard et al. 1996) (Heijstek, Kranenburg, et Borel Rinkes 2005). Il a été décrit que la réponse inflammatoire innée déclenchée par l’injection de cellules tumorales dans la souris et la présence de cellules tumorales mortes pourraient avoir un effet de vaccination, affectant la réponse à l’immunothérapie (Day, Merlino, et Van Dyke 2015). Malgré ces limites, les modèles de tumeurs implantés restent des outils précieux pour l'évaluation de l’immunothérapie. Selon le site d’implantation de la tumeur, on distingue plusieurs modèles.

3.1 Les modèles ectopiques

C’est le modèle le plus fréquemment utilisé dans lequel le site d’implantation est différent du site originel de la tumeur. Le plus souvent, l’injection de cellules ou l’implantation de fragments tumoraux est réalisée par voie sous-cutanée. Cette localisation permet d’évaluer la croissance tumorale facilement par mesure externe (McConville et al. 2007).

3.2 Le modèle Orthotopique

Ce modèle est obtenu par injection de cellules ou implantation de fragments tumoraux au site originel de la tumeur. Ces modèles sont invasifs car nécessitent de réaliser une chirurgie sur les animaux mais aussi moins reproductibles. L’évaluation de la croissance des tumeurs nécessite l’accès à des méthodes d’imagerie (Johanne Seguin. 2013). Cependant, les tumeurs prolifèrent dans leur microenvironnement tumoral naturel, ce qui en fait un modèle plus prédictif de la réponse aux traitements (McConville et al. 2007).

159 3.3 Les modèles de métastases

Ces modèles sont obtenus soit à partir de modèles orthotopiques qui forment des tumeurs primaires et donnent ensuite lieu à des métastases dans les sites d’invasion, soit par injection de cellules tumorales directement dans le site de métastases. Le temps d’obtention est plus rapide et leur manipulation est plus éthique que lors de l’utilisation de modèles orthotopiques (Jung 2014).

Dans l’article 2, nous avons utilisé un modèle de tumeurs implantées par voie sous cutanée pour mimer des métastases primaires et secondaires. Afin de mieux évaluer la réponse à la thérapie par RFA associée à l’immunomodulation locale, nous avons tenté de mettre en place un modèle plus pertinent et représentant au mieux la situation clinique. Ainsi, nous avons caractérisé le microenvironnement immunitaire dans un modèle de métastases hépatiques.

3.4 Mise en place du modèle intrahépatique

3.4.1 Procédure d’injection des cellules dans le foie

Après anesthésie gazeuse par isoflurane, la peau des souris Balb/c est désinfectée et une ouverture de 5 mm sous le xiphoïde est réalisée. Le lobe inférieur gauche du foie est alors placé sur une compresse stérile, et une injection sous capsulaire (5*104 CT26-Luc / 30 µl de PBS) de la suspension cellulaire est effectuée dans la portion paramédiane du lobe gauche. Une fermeture du plan musculaire et de la peau est ensuite réalisée (Figure 31).

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3.4.2 Suivi de la croissance tumorale par imagerie de bioluminescence

Cette méthode permet un suivi longitudinal de la croissance tumoral sans sacrifice des animaux. Les CT26 ont été modifiées génétiquement pour exprimer la luciférase (unpublished data). Cette enzyme oxyde son substrat, la luciférine et passe ainsi d’un état électroniquement stable à un état excité. L’émission d’un photon lui permet de retourner à son état stable. Cette réaction repose sur une réaction enzymatique nécessitant de l’ATP et de l’oxygène et ne permet des mesures quantitatives qu’en présence de cellules vivantes.

Luciférine (substrat) + Luciférase (enzyme) + ATP + O2  Oxyluciférine + Photons.

L’acquisition du signal de bioluminescence est réalisée tous les trois jours (cf article 1). L’analyse des résultats obtenus ont mis en évidence une augmentation exponentielle du signal de bioluminescence dans la zone du foie des souris en fonction du temps (Figure 32A). Les images montrent un signal de bioluminescence diffus dans tout le foie des souris (Figure 32B).

Figure 32 : Suivi de la croissance des tumeurs CT26-Luc dans le foie. (A) Quantification du signal de

bioluminescence (n=5) en fonction du temps. Les résultats sont exprimés en ph/s/sr/cm2. (B) Représentation

de la croissance tumorale par imagerie de bioluminescence à J5, J9, J11 et J14 après injection des cellules tumorales dans le foie.

3.4.3 Etude histologique des tumeurs dans le modèle intrahépatique

Les foies des souris ont été prélevés 14 jours après injection des cellules tumorales et fixés au PBS-PFA 4 % pendant 24h. Les organes sont ensuite congelés par immersion dans l’isopentane refroidi par de l’azote liquide. Des coupes de 6 μm ont été réalisées au cryostat suivies d’une coloration à l’hématoxyline-éosine. Les foies prélevés présentent une tumeur localisée et

A B 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0 40000 80000 120000 160000 200000 Temps (jours) p h /s /c m 2 /s r

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délimitée à un lobe hépatique (Figure 33A). Les coupes au cryostat ont confirmé cette observation (Figure 33B). Ainsi, les tumeurs sont délimitées et localisées sans envahissement de la structure du tissu hépatique (Figure 33C). La tumeur est constituée de cellules fusiformes et de cellules épithéliales de type glandulaire (Figure 33D).

Figure 33 : Marquages histologiques des foies implantés avec des cellules CT26-Luc. (A-B) Aspect macroscopique de la tumeur après prélèvement et congélation des organes. (C) Coupe histologiques montrant les cellules hépatiques (H) et les cellules tumorales (T). (D) Aspect de la tumeur formée de cellules fusiformes (F) et de cellules glandulaires (G).

3.5 Etude de microenvironnement immunitaire dans le modèle intrahépatique.

Nous avons évalué le microenvironnement immunitaire dans le modèle intrahépatique (IH) en comparaison avec les modèles de tumeurs sous-cutanées (SC) et orthotopiques (Seguin et al. 2013). Les tumeurs sont prélevées, dissociées et des marquages des cellules immunitaires ; des lymphocytes T effecteurs (CD4+) et T cytotoxiques (CD8+), des cellules dendritiques (CD11C+, CD80+, CD86+), des macrophages (F4/80) et des cellules myéloïdes suppressives (Ly6-G/Gr1 CD11b) sont réalisés (cf article .2).

Figure 34, nous pouvons observer une augmentation du pourcentage de lymphocytes T CD4+

dans le modèle SC (53,67 ± 1,67) comparé au modèle IH (23,06 ± 1,86) et au modèle Orthotopique (23,35 ± 5,01). Le pourcentage de lymphocytes T CD8+ est comparable pour les trois modèles (approximativement 15%). Le pourcentage de MDSC est augmenté d’un facteur 2 dans le modèle orthotopique (63,75 ± 4,55) comparé au modèle SC (33,4 ± 5,1) et au modèle IH (31,9 ± 4,22). La proportion de DC et de macrophages ne semble pas être modifié en fonction du site d’implantation.

162

Figure 34 Analyse des populations immunitaires dans des modèles de tumeurs colorectales CT26-Luc. Modèle SC (bleu), modèle intrahépatique (vert) ; modèle orthotopique (rouge). n=5 mean+/- SD

163 4. Discussion et perspectives

4.1 Agoniste du BCG

Nous avons remplacé le BCG par le PPD dans la formulation de gel immunomodulateur. Les résultats obtenus ont montré une efficacité inférieure à celle du BCG. Une étude a montré que les souris répondaient moins à la stimulation par le PPD que par d’autres antigènes de mycobactéries (Garcia-Pelayo et al. 2015). Il serait ainsi nécessaire de tester d’autres types d’antigènes qui pourraient avoir un effet équivalent à celui du BCG proposé dans notre stratégie. Par ailleurs, la formulation de gel pourrait être modifiée afin d’encapsuler un dérivé lipophile du BCG.