Evaluation de la contribution respective des CPBAg sur le développement de

a. Sur la prévalence d’infection

Afin d’évaluer le rôle des CPBAg sur le développement de Plasmodium falciparum plusieurs séries de moustiques inactivés génétiquement pour l’expression de cpbAg1, cpbAg2 et pour les deux gènes en même temps ont été infectées par des gamétocytes produits in vitro par le CEPIA. Huit jours après l’infection, la présence d’oocystes dans les tubes digestifs d’A. gambiae a été évaluée.

Les résultats de prévalence d’infection de deux expériences indépendantes sont présentés figure R.II.8. Iles montrent les différences obtenues sur la prévalence d’infection (qui traduit le nombre de moustiques infectés) entre les moustiques inactivés pour l’expression de cpbAg1 et/ou

cpbAg2 et ceux injectés de ds GFP utilisés comme contrôle mimant l’effet de l’injection sur les

moustiques. L’analyse statistique des données utilise un test χ2

avec 10⁵ permutations.

Les résultats de la première infection présentés figure R.II.8 montrent une baisse du nombre de moustiques infectés quelque soit la condition d’inactivation avec des taux très

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significatifs lorsque cpbAg1 est inactivé. La seconde infection présente un phénotype moins prononcé que la première du fait probable d’un taux d’infection faible chez le contrôle.

Cette expérience montre que le développement plasmodial est absent lorsque cpbAg1 est inactivé et cela même si cpbAg2 est surexprimé reflet de la dépendance du parasite envers l’activité de la 1^ère CPBAg. Or d’après les données enzymatiques du chapitre I, CPBAg1 contribue à la source d’arginine et de lysine lors du processus digestif alors que CPBAg2 n’augmente que le pool d’arginine. C’est donc soit l’absence de lysine qui bloque le développement de P. falciparum chez A. gambiae soit l’arginine engendré par la seule activité de CPBAg2 qui ne comble pas les besoins parasitaires. Du fait de la surexpression du transcrit de cpbAg2 par rapport à celui de

cpbAg1 et que la protéine CPBAg2 possède une vitesse d’action et une meilleure affinité pour

l’arginine, la dépendance métabolique du parasite semble être accrue envers la lysine, indispensable au bon déroulement du cycle parasitaire chez son hôte moustique.

Lorsque l’expression de cpbAg2 est inactivée, la prévalence diminue même si cpbAg1 est surexprimé d’après les données qPCR. Cependant, la significativité du phénotype est moindre que celle observé en contexte ds cpbAg1. L’effet de ds cpbAg2 semble être plus prononcé dans l’infection où le taux de prévalence de l’infection contrôle est plus faible. Alors que l’on pouvait s’attendre aux mêmes résultats qu’en contexte d’inactivation de cpbAg1 seul, lorsque l’expression des deux gènes est inactivée simultanément les résultats obtenus sont plus ambigus. Ils montrent une diminution plus faible de la prévalence d’infection similaire à celle trouvée en contexte d’inactivation de ds cpbAg2 seul pour la 1^ère infection. Dans le cas de la seconde infection la prévalence est même supérieure à celle obtenue chez les moustiques inactivés pour l’un ou l’autre gène. D’autres mécanismes compensant la perte de ces ressources d’acides aminés doivent certainement prendre le relais pour combler les besoins en acides aminés des moustiques dépourvus de carboxypeptidase. Les aminopeptidases d’A. stephensi peuvent libérer entre autres

Figure R.II.9 : Intensité d infection traduisant le nombre d oocystes par tube digestif de moustiques infectés en fonction des différentes conditions d inactivations

Analyse statistique par le test de Wilcoxon, Man, Whitney et Rank sum avec 10⁵ permutations

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de l’arginine et de la lysine, bien que leur spécificité première soit à l’encontre des résidus hydrophobes. Si les mêmes caractéristiques biochimiques sont respectées chez A. gambiae, leurs inductions pourraient compenser un défaut d’arginine. Chez le moustique la voie de biosynthèse d’arginine à partir de proline et de glutamate et/ou d’ornithine pourrait également augmenter en efficacité.

Cependant, comme les prévalences du contrôle dsGFP diffèrent d’une infection à l’autre, la comparaison des réplicats impose une méta-analyse par la méthode de Fischer qui combine les p-value des différents réplicats. La comparaison des deux infections révèle un blocage significatif du développement parasitaire engendré par l’inactivation de cpbAg1 et une tendance allant dans le même sens pour l’inactivation génique de cpbAg2 et des deux gènes en combiné.

b. Sur l’intensité d’infection

A la suite de l’analyse des prévalences d’infections dans les différentes conditions d’inactivation des cpbAg décrites ci-dessus, l’intensité d’infection reflétant le nombre d’oocystes par tube digestif infecté a été également analysée. Les résultats ont été traités par le test statistique de Wilcoxon, Man, Whitney et Rank sum avec 10⁵ permutations. Pour analyser les deux infections et pour les mêmes raisons que celles citées ci-dessus, une méta-analyse par la méthode de Fischer combinant les p-value des différents réplicats a été utilisée. Le nombre de moustiques infectés étant faible (figure R.II.9), cette expérience ne permet pas d’observer un phénotype significatif sur le développement parasitaire mais suffisant pour dégager néanmoins une tendance dans ces résultats.

Les résultats obtenus lorsque cpbAg1 est inactivé semble être contradictoires entre les deux infections. Les tendances observées montrent une diminution de l’intensité d’infection dans la première et une augmentation de celle ci dans la seconde. Plusieurs possibilités pourraient expliquer ce résultats : soit que cpbAg1 n’a pas d’influence sur l’intensité d’infection, soit qu’en fonction de la prévalence la dépendance des besoins parasitaires diffèrent, soit que la surexpression compensatoire de cpbAg2 suffit pour engendrer un complément en acide aminé libre pour combler les besoins du parasite. Ces résultats reflètent bien la complexité du système d’étude. Ces données suggèrent également une augmentation de l’intensité d’infection lorsque

cpbAg2 est inactivé. Comme dans ce contexte cpbAg1 est surexprimé, la dépendance parasitaire en

lysine et/ou arginine libéré par l’activité de CPBAg1 pourrait ainsi influencer l’intensité d’infection en augmentant le nombre d’oocystes dans les tubes digestifs infectés. En contexte de double inactivation, l’intensité d’infection semble augmenté par rapport au control, ceci suggère l’existence d’un mécanisme compensatoire qui semble se mettre en place lorsque le moustique est privé de l’apport d’acides aminés basiques engendré par l’activité des CPBAg.

Pour résumer, ces résultats montrent que cpbAg1 est nécessaire au développement plasmodial reflet probable d’une dépendance métabolique accrue envers la lysine comparé à l’arginine. Les résultats sur l’inactivation de cpbAg2 moins significatif, pourraient être due à un effet moindre de l’activité de cette protéine sur le parasite soit que la surexpression de cpbAg1 masque l’effet de son inactivation sur le développement parasitaire. De plus, des différences de phénotype en fonction du taux d’infection ne sont également pas à exclure. La surexpression compensatoire de cpbAg2 lorsque cpbAg1 est inactivé observée lors de l’étude de l’expression des gènes en condition d’interférence ARN n’a donc aucun effet sur le développement de Plasmodium

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3. Evaluation de la contribution respective des CPBAg sur la