Etudes des solutions cristallisées

Quatre types de poudres ont été analysés. La première a été obtenue par lyophilisation des solutions de dicarboxylates alcalins du cyclopeptide [1]. La seconde a été obtenue par séchage de ces mêmes solutions sur le cristal de l’appareil d’ATR-FTIR. La troisième a été obtenue par séchage de ces mêmes solutions sur plaques de verre. Et la quatrième a été obtenue par séchage sur film de carbone de la grille de TEM. Les trois premières ont été analysées par ATR-FTIR et la dernière par diffraction des électrons. Les assemblages supramoléculaires ont été contrôlés par microscopie lorsque cela était possible.

a. Analyse par ATR-FTIR.

i. Analyse du cyclopeptide sous forme de poudres lyophilisées.

Les résultats montrent la présence d’une bande amide I à 1628 cm-1, plus ou moins prononcée selon le contre-ion analysé et la bande amide I à 1688 cm-1 est décelable. Une forte bande à 1640 cm-1 (bande Random) est également observée. (Graphique III-5)

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 nombre d'onde (cm-1) Absorbance peptide diacide peptide 2(COO- Li+) peptide 2(COO- Na+) peptide 2(COO- K+) peptide 2(COO- Rb+) peptide 2(COO- Cs+)

Graphique III-5 : Courbes d’ATR-FTIR des poudres lyophilisées du cyclopeptide [1] sous forme de di-sel en fonction du contre-ion choisi comparées aux bandes amides I et II.

Ces bandes laissent penser qu’une partie du cyclopeptide [1] est assemblée par liaisons hydrogène en feuillet β antiparallèle alors que la majorité ne l’est pas. Ce qui semble montrer que cette poudre présente un faible degré d’organisation.

ii. Cristallisation sur l’appareil d’ATR-FTIR.

L’étude consiste ici à laisser sécher une goutte de solution du cyclopeptide [1] sous forme de dicarboxylate de lithium directement sur le cristal d’ATR. Les informations données par l’appareil permettront non seulement de déterminer la présence de feuillets β dans la structure cristallisée mais également de suivre la formation de l’organisation au cours du séchage.

Une solution de cyclopeptide [1] à 2 mg.mL-1 sous forme de di-sel de lithium a

recouvert la totalité du cristal d’ATR. (Graphique III-6)

Le graphique montre que dans les premiers temps aucune liaison hydrogène n’existe (de t = 0 à 50 min). Lorsque la goutte est proche du séchage (à t = 55 min), deux bandes

importantes apparaissent à 1650 et 1545 cm-1. Leur intensité ne sera plus modifiée après séchage complet, même après 18 h.

La bande à 1650 cm-1 correspond à la bande Random, et aucune bande Amide I ou II n’est obtenue. 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 nombre d'onde (cm-1) Absorbance à t 0 à t 10 min à t 20 min à t 35 min à t 40 min à t 45 min à t 50 min à t 55 min à t 60 min à t 70 min à t 110 min à t 18 h peptide diacide

Graphique III-6 : Courbes d’ATR-FTIR de la dynamique de séchage d’une goutte de cyclopeptide [1] sous forme de di-sel de lithium comparées aux bandes amides I et II.

Les données d’ATR-FTIR indiquent qu’il n’y a pas de liaisons hydrogène en feuillets β antiparallèles. Par contre, de nombreuses liaisons hydrogène sont créées lors du séchage. Le cristal d’ATR-FTIR ne pouvant être regardé par microscopie, il est difficile de réaliser une relation entre les assemblages supramoléculaires et la formation de liaisons hydrogène lors du séchage. Pour tenter d’établir une telle relation, nous allons analyser la cristallisation sur plaques de verre. En effet, les plaques de verre pourront être analysées par les deux techniques ATR-FTIR et microscopie TOM.

iii. Analyse de la cristallisation sur plaques de verres.

Une plaque de verre sur laquelle une goutte de solution est séchée peut être analysée à la fois par microscopie TOM et par ATR-FTIR.

L’analyse est réalisée avec le cyclopeptide [1] sous forme de di-sel. (Graphique III-

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 nombre d'onde (cm-1) Absor bance poudre diacide peptide 2(COO- Li+) peptide 2(COO- Na+) peptide 2(COO- K+) peptide 2(COO- Rb+) peptide 2(COO- Cs+)

Graphique III-7 : Courbes d’ATR-FTIR des gouttes séchées sur plaque de verre du cyclopeptide [1] sous la forme de di-sel en fonction du contre-ion choisi comparées aux bandes amides I et II.

Des bandes pour chaque échantillon analysé sont observées aux mêmes longueurs d’onde. La bande à 1688 cm-1 correspond à une des deux bandes amides I . La bande à 1540 cm-1 correspond à la bande Amide II. La plus forte bande, à 1621 cm-1 pourrait correspondre à l’autre bande Amide I mais avec un décalage de quelques nombres d’onde.

Ainsi, cette nouvelle analyse montre qu’une quantité non négligeable de feuillets β antiparallèles sont a priori présents dans les structures supramoléculaires obtenues. En effet, très peu de Random est observé.

Cette étude montre ainsi que l’organisation dépend étroitement de la surface sur laquelle le cyclopeptide [1] sous forme de di-sel est cristallisé.

iv. Conclusion.

Trois conclusions importantes peuvent être tirées de ces études en ATR-FTIR. La première est que l’organisation du cyclopeptide [1] sous forme de di-sel quel que soit le contre-ion utilisé n’a lieu que sous la forme cristallisée. Ensuite, cette organisation dépend de la surface sur laquelle la solution est séchée et/ou des conditions de séchage. Enfin, l’assemblage supramoléculaire montre une quantité importante de liaisons hydrogène, notamment en feuillets β anti-parallèles.

b. Analyse par diffraction des électrons.

L’échantillon analysé par diffraction correspond à une solution de cyclopeptide [1] sous forme de dicarboxylate de lithium cristallisée sur film de carbone de grille de TEM. Les images obtenues montrent des structures supramoléculaires. (Images III-12)

Images III-12 : Images TEM d’une solution du cyclopeptide [1] sous forme de di-sel de lithium.

Les clichés de diffractions sont réalisés à partir des images observées. (Images III-13)

Images III-13 : Clichés de diffraction de zones différentes pris sur l’échantillon provenant d’une solution du cyclopeptide [1] titrée par la lithine à pH 9.

La première constatation est que les objets observés diffractent, preuve que ce sont bien des objets organisés. Ensuite, on peut observer des taches de diffraction plus importantes le long d’un axe, ce qui montre que la maille est répétitive et orientée dans des directions privilégiées. La position des taches diffère d’un cliché à l’autre car les cristaux ne doivent pas être orientés dans les mêmes directions.

Les paramètres de mailles sont inversement proportionnels à la distance des taches au centre du cliché de diffraction. Malheureusement, les paramètres de mailles ne peuvent pas être mesurés. En effet, l’appareil n’est pas calibré pour réaliser ce type de mesure et rien ne permet de donner une idée des dimensions des cristaux.

Ainsi, la diffraction a permis de mettre en évidence que les structures supramoléculaires étaient très ordonnées. En revanche, il n’est pas possible de déterminer les paramètres de mailles de ces cristaux par les clichés réalisés.

4. Conclusion.

Des analyses en ATR-FTIR et en diffraction des électrons ont été réalisées afin de comprendre les organisations supramoléculaires obtenues. L’ATR-FTIR a permis de mettre en évidence que des liaisons hydrogène en feuillet β antiparallèles constituaient une des interactions permettant l’organisation supramoléculaire. De plus la diffraction des électrons réalisées en TEM sur ces échantillons montre une très importante organisation dans des directions privilégiées. Il serait intéressant de réaliser une analyse ATR-FTIR sur une solution saturée en cyclopeptide [1] sous la forme de di-sel quel que soit le contre-ion utilisé. En effet, cela permettrait de savoir s’il existe, juste avant la cristallisation des structures supramoléculaires en solution. Par contre, il sera difficile de s’assurer que cette solution sera capable de donner des structures car nous avons mis en évidence que les conditions de cristallisations sont importantes pour la formation de structures.

Nous avons alors les premiers éléments permettant de comprendre la structure mais l’assemblage n’est pas résolu.

Les problèmes qui se posent pour réaliser d’autres analyses, les rayons X par exemple, sont les dimensions des cristaux. Ils sont malheureusement trop petits pour être analysés. Des tentatives de formations de monocristaux ont échoués jusqu’à présent. Des analyses sur une ligne de SOLEIL par des Rayons X ultrasensibles pourraient être une solution et leur réalisation est en cours.

C. Les contre-ions organiques.