Etudes immunophénotypiques

Les cellules souches hématopoïétiques étant rares, il était essentiel de pouvoir les enrichir en éliminant les cellules matures qui expriment des antigènes de différentes lignées (Lin + pour lignage positif) et en sélectionnant les cellules plus immatures sur des critères phénotypiques (antigènes ou récepteurs membranaires) et/ou fonctionnels (expulsion de colorants vitaux par le biais d’une pompe d’efflux, résistance aux agents cytotoxiques). Les différents marqueurs antigéniques des CSH sont souvent mélangés afin d’améliorer la qualité et la fiabilité de la sélection.

3.1. Identification et sélection des CSH dans le modèle murin

Grâce au développement de techniques d’analyse par cytométrie de flux, les CSH de la moelle osseuse ont été phénotypiquement caractérisées, et ont pu être isolées afin de tester leur potentiel de reconstitution hématopoïétique. Ainsi, deux types de CSH ont pu être distingués: les LT-HSC (long term-Hematopoietic Stem Cells) ayant un potentiel de reconstitution du système hématopoïétique à long terme (au moins 6 mois), et les ST-HSC (short term - HSC) qui ne possèdent qu'une capacité d’auto-renouvellement limitée (1 à 3 mois) (Zhong et al., 1996; Zon, 2008). Toutes les CSH sont caractérisées par l'absence d'expression de marqueurs de surface caractéristiques des lignées myéloïdes, lymphoïdes et érythroïdes différenciées. Pour cela, ces cellules sont notées comme Lin- pour "lignage négatif". En plus de leur phénotype Lin-, les CSH expriment les marqueurs Sca-1(stem cell- associated antigen) et c-Kit (Okada et al., 1992). Il est maintenant admis que ces cellules Lin- Sca-1+ c-Kit+, dites LSK, qui représentent 0,05% à 0,1% des cellules totales de la moelle osseuse chez la souris (Morrison et al., 1995), sont très enrichies en LT-HSC (de l’ordre d’une cellule sur cinq) (Zon, 2008). Deux populations de CSH sont distinguées dans le compartiment des LSK : les LSK CD34+ qui présentent un potentiel ST-HSC et LSK CD34- qui sont principalement des LT-HSC (Osawa et al., 1996; Goodell et al., 1997; Sato et al., 1999). Il a été montré chez la souris qu’une seule cellule LSK CD34- était capable de reconstituer à long terme tout le système hématopoïétique (Osawa et al., 1996). D’autres antigènes sont également identifiés et comme Flt3 ((fms)-like tyrosine kinase receptor 3) qui a permis une nouvelle classification des CSH : les LT-HSC seront représentées par le phénotype LSK CD34- Flt3- alors que les ST-HSC seront divisées en deux fractions, les LSK CD34+ Flt3- (responsables de la reconstitution myéloïde rapide) et les LSK CD34+ Flt3+ (reconstitution lymphoïde rapide) (Yang et al., 2005). Deux antigènes de famille SLAM (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) sont également identifiés ; le CD150 qui est

Chapitre 1 : Etude bibliographique sur l’hématopoïèse

exprimé d’une façon spécifique par les CSH et les progéniteurs primitifs provenant de la moelle osseuse de souris, et le CD48 qui est exprimé sur des progéniteurs plus différenciés comme les colony forming cells (CFCs) (Kiel et al., 2005; Yang et al., 2005; Kim et al., 2006). Le phénotype CD150+ CD48- est identifié dans des cellules LT-HSC dans plusieurs souches de souris à différents âges (Yilmaz et al., 2006a).

D’autre part, les LT-HSC peuvent être caractérisées grâce à leur capacité à exclure des colorants fluorescents comme la rhodamine-123 et Hoechst 33342. L’analyse en cytométrie de flux après un marquage par le Hoechst 33342 permet de définir une population de cellules souches dite SP (side population) (Matsuzaki et al., 2004). Cependant, cette fraction SP n’est pas restreinte aux cellules souches du système hématopoïétique (Jackson et al., 2001).

L’aldéhyde déshydrogénase (ALDH) pourrait permettre aussi d’identifier et de sélectionner les CSH : Cette enzyme qui confère aux cellules une résistance aux agents alkylants tels que les dérivés actifs du cyclophosphamide est fortement exprimée dans les progéniteurs hématopoïétiques humains et murins (Armstrong et al., 2004). La fraction ALDHhigh SSClow sera la plus riche en LT-HSC (Hess et al., 2004). Cependant, l’expression élevée de l’ALDH semble ne pas être restreinte aux cellules souches du système hématopoïétique (Cai et al., 2004; Corti et al., 2006a; Corti et al., 2006b).

Le marqueur EPCR (Endothelial Protein C Receptor) ou CD201, à l’origine décrit comme marqueur des cellules endothéliales, est récemment identifié comme exprimé fortement par les CSH hautement purifiées en comparaison aux autres cellules de la moelle osseuse, et les cellules EPCR+ contiennent une importante population de SRC (Balazs et al., 2006).

3.2. Identification et sélection des CSH chez l’homme

Malgré les connaissances évolutives dans l’identification et la sélection des CSH chez l’homme au cours de ces dernières années, certains aspects concernant le phénotype de ces cellules restent encore controversés.

La fraction Lin- CD34+ CD38- est connue pour être enrichie en CSH primitives (type SRC). Certains antigènes exprimés par les CSH murines comme CD90(Thy.1) et CD117(c- Kit) ont été identifiés chez les CSH humaines (Briddell et al., 1992; Craig et al., 1993). Des CSH capables de reconstitution à long terme apparaissent donc dans le phénotype Lin- CD34+ CD38- CD90+ CD117low mais expriment également l’antigène CD133 (Yin et al., 1997). De plus, l’enzyme ALDH est aussi fortement exprimée par les CSH humaines et permet d’identifier la fraction Lin- CD34+ CD38- CD133+ ALDHhigh SSClow la plus enrichie

Tableau 7 : Phénotypes des Cellules souches hématopoïétiques murines et humaines aux différents stades de développement (D’après Ratajczak M.Z., 2008).

Lin- CD34+_CD38-

Lin- CD34+_CD133+_CXCR4+

CD150+_CD48-_CD244- _(SLAM)

ALDH high_{(e,g,, ALDH} high_CD133+_Lin-₎

Lin-_Sca-1high _c-Kit+_Thy1,1(CD90)low_(LSKT)

Lin-_Sca-1+ _CD34+/-_CD45+ CD150+_CD48-_CD244- _(SLAM) ALDH high CSH (moelle osseuse) CD34+_CD133+_CXCR4+_Lin- Sca-1+ _CD34+_CD45+_Mac-1+_CXCR4+ CSH (foie) CD34+ CD34+_CD45+_CD41+/- _Sca-1+/- CSH (AGM et placenta) ND CD34+_CD41+_Sca-1+_CD45- Pré-CSH (AGM) ND Flk-1 (KDR+) Hémangioblastes (sac vitellin) Système humain Système murin CSH Lin- CD34+_CD38- Lin- CD34+_CD133+_CXCR4+ CD150+_CD48-_CD244- _(SLAM)

ALDH high_{(e,g,, ALDH} high_CD133+_Lin-₎

Lin-_Sca-1high _c-Kit+_Thy1,1(CD90)low_(LSKT)

Lin-_Sca-1+ _CD34+/-_CD45+ CD150+_CD48-_CD244- _(SLAM) ALDH high CSH (moelle osseuse) CD34+_CD133+_CXCR4+_Lin- Sca-1+ _CD34+_CD45+_Mac-1+_CXCR4+ CSH (foie) CD34+ CD34+_CD45+_CD41+/- _Sca-1+/- CSH (AGM et placenta) ND CD34+_CD41+_Sca-1+_CD45- Pré-CSH (AGM) ND Flk-1 (KDR+) Hémangioblastes (sac vitellin) Système humain Système murin CSH

CSH= Cellules souches hématopoïétiques ; Région AGM= Aorte-Gonades-Mésonéphros ; SLAM= Signaling Lymphocyte Activation Molecule ; ALDH = Aldéhyde déshydrogénase ; ND= phénotype Non Déterminé pour les CSH humaines.

Chapitre 1 : Etude bibliographique sur l’hématopoïèse

marqueurs ALDH et CD133 a permis de définir le phénotype qui semblait être le plus représentatif des CSH humaines contenant des SRC : Lin- CD133+ ALDHhigh (Hess et al., 2006). Récemment, les travaux de Majeti et al. (Majeti et al., 2007), ont montré que le sang du cordon ombilical contient une fraction Lin- CD34+ CD38- CD90+ CD45RA- de CSH capables de reconstitution à long terme. En addition à ces CSH, ces auteurs ont identifié pour la première fois une fraction de cellules de phénotype Lin- CD34+ CD38- CD90- CD45RA- qui pourraient correspondre aux progéniteurs multipotents (MPP) (qui ont perdus les capacités d’auto-renouvellement).

Il est à noter que, contrairement au modèle murin, la capacité d’exclusion du Hoechst ne semble pas une méthode de choix pour sélectionner les CSH primitives chez l’homme parce qu’elles ne sont pas toutes contenues dans la fraction SP (Fischer et al., 2006; Pearce and Bonnet, 2007).

Dans le tableau 7 nous résumons les différents antigènes identifiés jusqu’à présents sur les différents types de cellules hématopoïétiques chez l’homme et la souris à partir des données extraites d’une revue récente (Ratajczak, 2008).

Phénotypes Assays

Phénotypes Assays

Figure 20 : Les caractéristiques phénotypiques des cellules hématopoïétiques et les méthodes d’identification utilisées.

Les approches CRU et SRC sont utilisées pour étudier la capacité de reconstitution des CSH. LTC-IC et CAFC permettent d’identifier des populations de progéniteurs très primitifs. Les HPP-CFC et les essais de clonogénicité sont utilisés pour détecter des progéniteurs multipotents primitifs (comme CFU-GEMM) ou des progéniteurs oligopotents (e.g. CFU-M, BFU-E, CFU-Mk et CFU-E). Les cellules périphériques matures sont identifiées grâce à leurs propriétés morphologiques et fonctionnelles et la présence d’antigènes spécifiques.

CRU= Competitive Repopulating Unit ; SRC= SCID Repopulating Cell (mouse) ; LTC-IC= Long-Term Culture- Initiating Cells ; CAFC= Cobblestone Area-Forming Cells ; HPP-CFC= High Proliferative Potential-Colony Forming Cells ; CFU-GEMM= Colony Forming Unit-Granulocyte, Erythrocyte, Macrophage, Megakaryocyte.