ETUDE DE LA PCP CHEZ LES SOURIS DEFICIENTES POUR TRAF4

La convergence-extension dépend directement de la PCP et l’altération des composants de la voie Wnt/PCP perturbe ce mécanisme conduisant majoritairement à un défaut d’élongation de l’axe du corps de l’embryon et a un défaut de fermeture du tube neural (Ybot- Gonzalez et al., 2007). Nous avons émis l’hypothèse que, certains des phénotypes rapportés chez les souris TRAF4 -/-, comme l’altération de fermeture du tube neural reflétaient son implication dans la polarité planaire. Afin de tester cette hypothèse, nous avons comparé la morphologie d’embryons à 9.5 jours de gestation déficients pour TRAF4 à celle d’embryons contrôles. Ces expériences ont été réalisées à partir de croisements hétérozygotes. La comparaison morphologique d’embryons issus de la même portée indique que l’axe du corps des embryons déficients pour TRAF4 est plus court que celui des embryons sauvages (figure 45). De plus, leurs somites sont moins larges et plus hautes (Figure 45A). Ce phénotype est caractéristique d’un défaut d’élongation de l’embryon.

En collaboration avec Muriel Rhinn (Equipe « Rôle de l'acide rétinoïque dans le développement de la souris », dirigée par Pascal Dollé, IGBMC), nous avons prélevé et analysé cent embryons issus de croisements entre souris hétérozygotes pour la délétion de TRAF4 afin de calculer la fréquence d’apparition des phénotypes liés à un défaut de polarité planaire. En plus de confirmer que la déficience de TRAF4 conduit à un défaut de fermeture du tube neural dans plus de 45% des embryons (Régnier et al., 2002), cette étude montre un défaut d’élongation, caractérisé par un embryon plus court et plus large, dans environ 40%

Apical Basal Cellules de soutien CCE 1 CCE 2 CCE 3 CCI CCE 1 CCE 2 CCE 3 CCI

Embryon TRAF4 +/+ Embryon TRAF4 -/-

Phalloïdine Tubuline Acétylée CCE 1 CCE 2 CCE 3 CCI APICAL BASAL B 6 _{6 6 6 6} 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 _{6 6} 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 6 5 5 5 6 6 5 4 5 6 5 6 6 5 4 5 5 5 4 4 4 4 4 7 5 5 5 5 5 4 5 6 5 5 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 5 CCE 1 CCE 2 CCE 3 CCI

Figure 47 : La délétion de TRAF4 chez la souris perturbe la polarité planaire des cellules de l’oreille interne A. Schéma représentant une coupe transverse de l’organe de Corti, un organe sensoriel faisant partie intégrante de la

cochlée. Cet organe est constitué de cellules de soutien qui supportent une rangée de cellules ciliées internes (CCI) et trois rangées de cellules ciliées externes (CCE).

B. Après dissection des oreilles internes d'embryons à 18,5 jours de gestation, la cochlée a été isolée puis l’actine et

la tubuline acétylée ont été marquées avec respectivement de la phalloïdine et un anticorps anti-tubuline acétylée. Les images ont été acquises au microscope confocal. Sur le côté basal le nombre de contacts avec les cellules adjacentes a été compté, les CCE avec un nombre normal de contact (6) sont indiquées en jaune, les CCE avec un nombre altéré de contacts sont indiquées en rouge (4), orange (5) et bleu (7).

106 convergence-extension.

Il a récemment été décrit que la convergence-extension est primordiale pour l’élongation de la cochlée au cours du développement embryonnaire. Afin de savoir si la délétion de TRAF4 perturbe l’élongation de la cochlée, les oreilles internes d’embryons ont été prélevées à 18.5 jours de gestation et les cochlées ont été observées au macroscope. De manière intéressante, 100% des cochlées des embryons déficients pour TRAF4 sont plus courtes et plus larges que celles des embryons sauvages (Figure 46). Ce phénotype ressemble à celui des souris déficientes pour Vangl2 et Dvl-2, deux acteurs majeurs de la PCP (Chacon- Heszele et al.; Wang et al., 2006). Ce résultat illustre également le défaut du mécanisme de convergence-extension au sein des embryons TRAF4 -/-.

Dans leur ensemble, ces données montrent que TRAF4 est impliqué dans le mécanisme de convergence-extension et que la délétion de TRAF4 conduit à un défaut de fermeture du tube neural ainsi qu’à une altération de l’élongation de l’axe de l’embryon et de la cochlée. Ces résultats renforcent donc l’idée que TRAF4 soit impliqué dans la voie Wnt/PCP.

2.2.2. Etude de la PCP au sein de la cochlée

La cochlée est l’organe de référence pour étudier la PCP. En effet, dans cet organe, deux phénotypes sont directement associés à un défaut de PCP : la présence d’un nombre anormal de rangées de cellules ciliées externes et une mauvaise orientation du faisceau de cils des cellules ciliées (Ezan and Montcouquiol, 2013; May-Simera and Kelley, 2012). Ce faisceau de cils est composé d’un kinétocil et de 20 à 300 stéréocils. Le kinétocil peut être marqué spécifiquement avec un anticorps anti-tubuline acétylée tandis que les stéréocils, riches en actine, peuvent être marqués à la phalloïdine (Figure 47) (Chacon-Heszele et al.; Ezan and Montcouquiol, 2013; Wang et al., 2005).

Afin de savoir si les souris déficientes pour TRAF4 ont un défaut de polarité planaire, les oreilles internes de sept embryons sauvages et sept embryons déficients pour TRAF4 ont été prélevées à 18,5 jours de gestation. Après avoir isolé la cochlée, la membrane basilaire et l’organe de Corti ont été prélevés et fixés. La morphologie des cellules ciliées a été observée grâce à un immunomarquage de la tubuline acétylée et un marquage à la phalloïdine (Montcouquiol et al., 2003). Les pièces ont été montées entre lame et lamelle et observées au microscope confocal. Les souris déficientes pour TRAF4 présentent une altération de la morphologie de l’organe de Corti caractérisée par une fusion entre les rangées CCE 2 et CCE

SMURF2-Flag

Superposition

TRAF4-EYFP Superposition

Figure 48 : En co-expression TRAF4 colocalise avec les protéines SMURFs

A. Des cellules MCF7 ont été transfectées avec un vecteur d’expression pour TRAF4-EYFP,

SMURF1-Flag ou SMURF2-Flag. Après fixation et perméabilisation, les cellules ont été marquées avec un anticorps anti-Flag (rouge).

B. Des cellules MCF7 ont été co-transfectées avec un vecteur d’expression pour TRAF4-EYFP et

un vecteur d’expression pour SMURF1-Flag ou SMURF2-Flag. Après fixation et perméabilisation, les cellules ont été marquées avec un anticorps anti-Flag (rouge). Barre d’échelle : 5 µm.

SMURF2-Flag Superposition

Simple transfection SMURF2

SMURF1-Flag Superposition

TRAF4-EYFP Superposition

Simple transfection TRAF4

co-transfection SMURF1 + TR A F4 co-transfection SMURF2 + TR A F4 2.5 X 2.5 X

107 dans les souris sauvages chaque cellule ciliée externe est en contact avec six cellules voisines et ont une forme hexagonale (Figure 47); les CCEs des souris déficiente en TRAF4 ont une forme altérée et présentent un nombre anormal de contacts intercellulaires (Figure 47). Ce phénotype est remarquablement similaire à celui des souris déficiente pour SMURF2 (Narimatsu et al., 2009).

Dans leur ensemble, ces données génétiques montrent que TRAF4, à l’instar des protéines SMURFs, est impliqué dans la polarité planaire. De plus, le fait que TRAF4 interagisse avec les protéines SMURFs (Li et al., 2010) suggère que TRAF4 pourrait appartenir au complexe SMURFs/PAR6/Dvl2.

2.3. ETUDE DE LA LOCALISATION SUBCELLULAIRE DE TRAF4 ET