Annexe-2 : TRAF4 promotes TGF-β receptor signaling and drives breast cancer metastasis

Dans cet article, les auteurs montrent que TRAF4 contribue à l’induction de la voie de signalisation médiée par le TGF-β. Après traitement au TGF-β, TRAF4 interagit avec les récepteurs TβRI et TβRII, et empêche la polyubiquitinylation du récepteur TβRI. Cela se traduit par une stabilité accrue des récepteurs aux TGF-β et une augmentation de la signalisation par la voie canonique (médiée par les SMADs). Au niveau moléculaire, TRAF4 prévient la polyubiquitinylation du récepteur TβRI de deux façons : TRAF4 polyubiquitinyle (K48) SMURF2, ce qui induit sa dégradation via le protéasome 26S et TRAF4 recrute la déubiquitinase USP15 qui enlève les chaines d’ubiquitines des récepteurs TβRI. De plus, le recrutement de TRAF4 au niveau des récepteurs conduit à sa polyubiquitinylation de type K63 ce qui active la voie de signalisation TGF-β non-canonique dépendante de TAK1 (TGF-β Activated Kinase 1). Au niveau fonctionnel, cet article établi que TRAF4 contribue à l’induction de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) médiée par le TGF-β. En corolaire, la sous-expression de TRAF4 diminue fortement la formation de métastase dans des

115 SMAD2 et TAK1 et à un mauvais pronostique. Dans les paragraphes suivants, je vais discuter la cohérence de ces résultats avec mes données personnelles et celles de la littérature.

1.2. TRAF4, activateur ou répresseur de SMURF2 ?

Nous avons montré que la co-expression de TRAF4 avec SMURF1 et SMURF2 délocalise ces protéines SMURFs dans des structures ponctiformes cytoplasmiques positives pour TRAF4 (Figure 48). Cet effet suggère que TRAF4 et les protéines SMURFs interagissent directement dans des complexes qui adoptent une nouvelle localisation subcellulaire. Au niveau moléculaire, TRAF4 polyubiquitinyle majoritairement SMURF2, et ce de manière dépendante de son domaine RING. En retour, les protéines SMURFs peuvent également polyubiquitinyler TRAF4 (Figure 49). Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Zhang et ses collaborateurs qui montrent que les protéines SMURFs (surtout SMURF2) ubiquitinylent TRAF4 et que TRAF4 polyubiquitinyle les protéines SMURFs (surtout SMURF2) (Annexe-2 : Figure-2). Ces polyubiquitinylations réciproques peuvent être directes car elles sont observées in vitro en utilisant des protéines SMURF1, SMURF2 et TRAF4 recombinantes (Annexe-2 : Figure-2H). Cette expérience a permis de montrer que TRAF4 polyubiquitinyle directement par son domaine RING, les protéines SMURFs et surtout SMURF2.

Nous avons observé que TRAF4 réalise de la polyubiquitinylation de type K63 (~ 65%) et de type K48 (~ 35%) sur SMURF2. Réciproquement, SMURF2 réalise également de la polyubiquitinylation de type K63 (~ 72%) et de type K48 (~ 28%) sur TRAF4 (Figure 50). L’assemblage d’une chaîne de polyubiquitine K48 sur une protéine est une marque conduisant à sa dégradation par le protéasome 26S tandis que l’assemblage d’une chaîne de polyubiquitine K63 ne conduit généralement pas à la dégradation du substrat mais modifie sa fonction et/ou sa localisation subcellulaire. Ces résultats suggèrent que TRAF4 et SMURF2 pourraient s’activer mutuellement. De manière surprenante, Zhang et ses collaborateurs montrent que TRAF4 greffe des chaînes de polyubiquitine K48 sur SMURF2 suite à un traitement au TGF-β, ce qui conduit à sa dégradation par le protéasome 26S (Annexe-2 : Figure-2K et -3). Néanmoins, dans tous les tests d’ubiquitinylation que j’ai réalisé, je n’ai jamais observé que la co-expression de TRAF4 avec SMURF2 conduisait à une diminution du taux de protéines SMURF2 dans le lysat. Nous avons utilisé la même lignée cellulaire HEK293T pour les expériences d’ubiquitinylation ; la plus grande différence concerne le

116 après transfection la polyubiquitinylation de SMURF2 par TRAF4 conduit à sa dégradation, alors que plus tardivement (36h), comme je l’observe, l’accumulation de SMURF2 dans les structures ponctiformes cytoplasmiques positives pour TRAF4, empêche sa dégradation. Cette hypothèse devra être vérifiée en mesurant la stabilité de la protéine SMURF2 en présence de TRAF4 lors d’une cinétique allant de 18 à 36h. De plus l’utilisation des mutants d’ubiquitine qui ne font que de la polyubiquitinylation de type K48 (Ub-6His-K48) ou K63 (Ub-6His- K63), permettra de connaitre le spectre de polyubiquitinylation au cours du temps.

Après traitement au TGF-β, TRAF4 est recruté au niveau des récepteurs TβRI et TβRII, où il est polyubiquitinylé (K63) de manière dépendante de son domaine RING (Annexe-2 : Figure-4). Ce résultat suggère que TRAF4, une fois recruté au niveau des récepteurs aux TGF-βs, pourrait s’auto-ubiquitinyler (K63). Les chaînes de polyubiquitine seraient ensuite reconnues par TAK1 qui induirait l’activation de la voie non-canonique du TGF-β. Pour notre part, nous avons observé que SMURF2 polyubiquitinyle fortement la protéine TRAF4 sauvage mais moins fortement TRAF4-mutRING (Figure 49). Ce résultat suggère que l’activité ubiquitine ligase E3 de TRAF4 contribue à son ubiquitinylation par SMURF2. Nous avons émis deux hypothèses : soit TRAF4 active SMURF2 par polyubiquitinylation, qui en conséquence polyubiquitinyle plus fortement TRAF4 ; soit la polyubiquitinylation de TRAF4 par SMURF2 active TRAF4 qui s’auto-polyubiquitinyle en retour. Nos résultats associés à ceux de Zhang confortent la seconde hypothèse. TRAF4 serait plus un régulateur négatif de SMURF2 qu’un activateur. Nous pourrions imaginer un modèle selon lequel TRAF4 est polyubiquitinylé par SMURF2, ce qui induit son activation. En retour, TRAF4 pourrait exercer un rétrocontrôle négatif en polyubiquitinylant SMURF2 et également s’auto- ubiquitinyler pour activer la voie non-canonique du TGF- β. Cette hypothèse ne satisfait pas toutes les observations rapportées dans la littérature. La régulation de SMURF2 par TRAF4 pourrait-être positive ou négative selon le contexte cellulaire. Par exemple, après traitement au TGF-β, TRAF4 est un répresseur de SMURF2 (Zhang et al., 2013). D’autres données suggèrent que TRAF4 agirait de concert avec SMURF2 dans certaines voies de signalisation suggérant plutôt une activation mutuelle de ces deux protéines. Premièrement, TRAF4 et SMURF2 peuvent conduire à la dégradation de p53 dans les cellules MCF7 (Nie et al., 2010; Yi et al., 2013). Deuxièmement, la perte de TRAF4 et celle de SMURF2 chez la souris engendrent un phénotype très similaire caractérisé par un défaut de fermeture du tube neural, une altération du mécanisme de convergence-extension, une altération de la PCP et la

Figure 52 : TRA4 et SMURF2 lient les PIPs et l’acide phosphati- dique

Etude de l’interaction de TRAF4 et SMURF2 avec les PIPs par «Lipid Overlay». A l’instar de TRAF4, SMURF2 lie l’ensemble des PIPs et l’acide phosphotidique. Cette interaction est médiée par le domaine C2 de SMURF2 (adapté de Weisner et al., 2007).

LPC PtdIns PI(3)P PI(4)P PI(5)P PE PC PI(3,4)P2 PI(3,5)P2 PI(4,5)P2 PI(3,4,5)P3 PA PS Blank PIPs SMURF2 SMAD7 TGFβR TGF-β

Figure 53 : Mécanisme du recrutement de SMURF2 au niveau des récepteurs au TGF-β

Les tétramères de TGFβR liés à leurs ligands vont initier la voie de signalisation du TGF-β. Un rétrocontôle négatif est médié par les protéines SMAD7 et SMURF2. Le recrutement membranaire de SMURF2 au niveau des récepteurs TGFβRs est dépendante de la liaison de ses domaines C2 et WW respectivement avec les PIPs et le motif PxxY de SMAD7. Une fois recruté SMURF2 polyubi- quitinyle les récepteurs TGFβR conduisant à leur dégradation par le protéasome 26S (adapté de Weisner et al., 2007).

117 (Jin et al., 2009; Yang et al., 2009; résultats § 3.2). Des études complémentaires sont donc nécessaires pour appréhender de manière exhaustive la relation entre TRAF4 et SMURF2.

1.3. Implication potentielle de la liaison aux PIPs dans l’activation de la