Etude du mutant shmt1-1

Le mutant shmt1-1 porte une mutation ponctuelle dans l’exon 13 de la séquence codante du gène ce qui occasionne un changement d’un acide aminé proline en sérine (Moreno et al., 2005) (Figure 20).

ATG shmt1-1

Figure 20: Structure du gène SHMT1 et position de la mutation chez shmt1-1 (les rectangles symbolisent les exons, les lignes symbolisent les introns). Taille du gène : 3197 pb.

Afin d’étudier le lien éventuel entre l’enzyme SHMT1 et la synthèse de la carnitine chez A.

thaliana une analyse par LC-ESI-MS/MS de la teneur en γ-butyrobétaïne (γ-BB) et en carnitine

libre a été initiée sur des extraits de plantules shmt1-1 et Col-0 cultivée in vitro sur du milieu M&S.

1.1.1 Analyse de la teneur en γ-BB

La teneur moyenne en γ-BB dans des extraits de plantules shmt1-1 de 72 h est de 2,187 ± 0,378 ng.mg^-1 MS contre 3,117 ± 0,589 ng.mg^-1 MS dans des extraits de plantules Col-0, soit une réduction de 29,8 % de la teneur en γ-BB chez le mutant (Figure 21). Il faut souligner que d’une manière générale une variabilité non négligeable est observée pour les dosages de précurseurs entre les expérimentations pourtant faites en conditions contrôlées et avec les mêmes génotypes.

Figure 21: Teneur en γ-BB dans des extraits de plantules d’A. thaliana Col-0 et shmt1-1 de 72 h cultivées sur milieu M&S (MS: matière sèche). Les résultats représentent la moyenne de trois

0 1 2 3 4 Col-0 shmt1-1 γ-BB (ng.mg-1MS)

répétitions biologiques indépendantes (± l’écart-type).

1.1.2 Analyse de la teneur en carnitine

Ces mêmes extraits végétaux ont été analysés d’un point de vue de la teneur en carnitine libre. Celle de plantules shmt1-1 est réduite d’environ 29,3 % par rapport à celle de plantules sauvages (Figure 22). En effet les plantules du mutant contiennent en moyenne 0,281 ± 0,097 ng.mg^-1 MS de carnitine libre contre 0,398 ± 0,086 ng.mg^-1 MS pour les plantules Col-0.

Dans la mesure où une fraction de la carnitine chez Arabidopsis est présente sous forme d’acyl-carnitines (Bourdin et al., 2007), une saponification a été faite sur des extraits végétaux afin de libérer cette fraction de carnitine liée pour quantifier la carnitine totale. Des extraits de plantules shmt1-1 cultivées in vitro pendant 72 h sur du milieu M&S contiennent 1,4 fois moins de carnitine totale en moyenne que les extraits obtenus à partir de plantes sauvages (0,393 ± 0,034 ng.mg^-1 MS contre 0,547 ± 0,107 ng.mg^-1 MS), soit une diminution de 28,1 %. De la même manière la carnitine estérifiée est diminuée de 24,3 % chez le mutant (0,112 ± 0,093 ng.mg^-1 MS contre 0,148 ± 0,048 ng.mg^-1 MS) (Figure 22).

Figure 22: Teneur en carnitine libre et estérifiée dans des extraits de plantules d’A. thaliana

Col-0 et shmt1-1 de 72 h cultivées sur milieu M&S (MS: matière sèche). Les résultats

représentent la moyenne de trois répétitions biologiques indépendantes (± l’écart-type concernant les valeurs de carnitine totale).

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Col-0 shmt1-1 carnitine estérifiée carnitine libre carnitine totale (ng.mg-1MS)

1.1.3 Analyse de la teneur en acyl-carnitines

Une quantification de la teneur en différentes acyl-carnitines de longueur de chaine carbonée variable a également été réalisée sur des extraits végétaux obtenus à partir de plantules de 72 h Col-0 et shmt1-1.

Figure 23: Teneurs en acyl-carnitines des plantules d’A. thaliana Col-0 et shmt1-1 de 72 h cultivées sur milieu M&S (MS: Matière Sèche) (C20: arachidoyl-canitine, C18: stéaroyl-carnitine, C18:1: oléoyl-carnitine, C16: palmitoyl-carnitine, C14: myristoyl-carnitine, C12: lauroyl-carnitine, C2: acétyl-carnitine).

Les teneurs en différentes acyl-carnitines d’extraits de plantules shmt1-1 et Col-0 ne semblent pas présenter de différence (Figure 23). D’autre part, la quantité totale d’acyl-carnitines analysées est de 14,3 pg.mg^-1 MS pour le génotype shmt1-1 et 15,1 pg.mg^-1 MS pour le génotype sauvage dans cette expérience. Une répétition biologique indépendante a donné des résultats comparables (13,5 pg.mg^-1 MS d’acyl-carnitines dans les extraits de

shmt1-1 contre 12,8 pg.mg^-1 MS dans les extraits de Col-0). Aucune différence de la teneur totale en acyl-carnitines n’a donc été constatée entre les deux génotypes. Il faut noter ici que cette teneur en différentes acyl-carnitines ne représente qu’environ 8,6 à 12,7 % de la fraction de carnitine libérée par saponification (Figure 22). Une fraction importante de carnitine estérifiée n’est donc pas identifiée au cours de ces analyses.

1.1.4 Etude du développement précoce du mutant shmt1-1

Des plantules shmt1-1 de 15 jours sont nettement moins développées que des plantules sauvages (Moreno et al., 2005). Il n’y a pas de donnée dans la littérature sur d’éventuelles

0 1 2 3 4 5 6 7 C20 C18 C18:1 C16 C14 C12 C2 Col-0 shmt1-1 acyl-carnitines (pg.mg^-1 MS)

différences phénotypiques visibles aux stades précoces de développement des plantules. Aussi il a été nécessaire d’étudier la germination et le développement de plantules de shmt1-1 afin de voir si les différences observées au niveau des teneurs en carnitine peuvent être liées à des phénotypes observables à ces stades.

Un suivi de la germination et du développement post-germinatif du mutant shmt1-1 a été réalisé. Des graines des deux génotypes semées sur milieu M&S ont été comptées et observées pendant 4 jours. Il a été constaté que 93 % des graines shmt1-1 et 92 % des graines Col-0 germent après 24 h de culture. Ceci montre que le pouvoir germinatif des graines n’est pas affecté par la mutation chez shmt1-1. Par contre après 72 h, 82,4 % des plantules du mutant et 92,8 % des plantules Col-0, présentent des cotylédons ouverts. Ces données sont significatives au regard d’un test X² (P < 0,001). D’autre part, bien qu’au même stade de développement, les plantules shmt1-1 et Col-0 ont des caractéristiques visibles différentes. En effet à partir de 48 h les plantules shmt1-1 apparaissent plus petites que les plantules Col-0 (Figure 24).

24h 48h 72h 96h

A

B

Figure 24: Suivi de la germination et du développement post-germinatif des plantules sauvages d’A. thaliana Col-0 (A) et du mutant shmt1-1 (B) sur milieu M&S.

Un retard de développement des plantes shmt1-1 cultivées 15 jours en serre est bien notable par rapport aux plantes Col-0. Les plantes shmt1-1 ont une taille plus petite, les feuilles sont plus nombreuses, moins développées et chlorotiques, par rapport aux feuilles des plantes Col-0 (Figure 25).

Figure 25: Plantes Col-0 et shmt1-1 cultivées en serre après 15 jours.