Etude de mutants perte de fonction de THA2

Concernant l’enzyme THA2, des mutants contenant des insertions d’ADN-T dans le premier et troisième intron du gène correspondant ont été identifiés (Figure 33) (Joshi et al., 2006). Ces insertions doivent être maintenues à l’état hétérozygote, soit THA2-1/tha2-1 et

THA2-2/tha2-2. En effet les graines homozygotes pour ces mutations sont albinos (Figure 34)

et arrêtent leur développement après la sortie des cotylédons (Joshi et al., 2006). Les deux lignées ont été utilisées dans le cadre de la recherche de protéines impliquées dans la synthèse de carnitine chez Arabidopsis.

ATG tha2-1 tha2-2

Figure 33: Structure du gène THA2 et position des insertions dans les lignées tha2-1 et tha2-2 (le losange symbolise le promoteur, les rectangles symbolisent les exons, les lignes symbolisent les introns). Taille du gène : 2521 pb.

(B)

Figure 34: Graines dans leur silique issues de plantes de génotype Col (B) et THA2-2/tha2-2 (C) (grossissement x

2.2.1 Effet d’un apport exogène de carnitine sur la germination et le développement de plantules hétérozygotes

D’après les données de la littérature, il n’est pas possible de restaurer la viabilité des plantules tha2-1 et tha2-2 par des apports exogènes en différents acides aminés (qu’il s’agisse de Met, Lys, Lys et Met, Thr, Ile ou

2006). Dans le cadre de notre étude, la protéine THA2 est envisagée comme pouvant intervenir dans la synthèse de l’acide aminé carnitine. Aussi un lien pourrait exister entre la teneur en carnitine des plantules et leur non viabilité. Afin de tester cette hypothèse une expérience d’apport exogène en carnitine à la concentration de 5 mM dans le milieu de culture utilisé pour la germination et le développement de plantules issues de plantes hétérozygot

insertions dans le gène THA2 a été initiée (

milieu est sans effet délétère pour le développement des plantules d’Arabidopsis (Charrier 2012).

(A)

(C)

: Graines dans leur silique issues de plantes de génotype Col-0 (A), (C) (grossissement x 30).

2.2.1 Effet d’un apport exogène de carnitine sur la germination et le nt de plantules hétérozygotes

D’après les données de la littérature, il n’est pas possible de restaurer la viabilité des par des apports exogènes en différents acides aminés (qu’il s’agisse de Met, Lys, Lys et Met, Thr, Ile ou Gly) dans le milieu de culture des plantes (Joshi et 2006). Dans le cadre de notre étude, la protéine THA2 est envisagée comme pouvant intervenir dans la synthèse de l’acide aminé carnitine. Aussi un lien pourrait exister entre la teneur en des plantules et leur non viabilité. Afin de tester cette hypothèse une expérience d’apport exogène en carnitine à la concentration de 5 mM dans le milieu de culture utilisé pour la germination et le développement de plantules issues de plantes hétérozygot

a été initiée (Figure 35). Cette concentration en carnitine dans le milieu est sans effet délétère pour le développement des plantules d’Arabidopsis (Charrier

0 (A), THA2-1/tha2-1

2.2.1 Effet d’un apport exogène de carnitine sur la germination et le

D’après les données de la littérature, il n’est pas possible de restaurer la viabilité des par des apports exogènes en différents acides aminés (qu’il s’agisse Gly) dans le milieu de culture des plantes (Joshi et al., 2006). Dans le cadre de notre étude, la protéine THA2 est envisagée comme pouvant intervenir dans la synthèse de l’acide aminé carnitine. Aussi un lien pourrait exister entre la teneur en des plantules et leur non viabilité. Afin de tester cette hypothèse une expérience d’apport exogène en carnitine à la concentration de 5 mM dans le milieu de culture utilisé pour la germination et le développement de plantules issues de plantes hétérozygotes pour les ). Cette concentration en carnitine dans le milieu est sans effet délétère pour le développement des plantules d’Arabidopsis (Charrier et al.,

THA2-1/tha2-1

MS (A) MS+carnitine (B)

THA2-2/tha2-2

MS (C) MS+carnitine (D)

Figure 35: Plantules d’A. thaliana THA2-1/tha2-1 (A, B) et THA2-2/tha2-2 (C, D) cultivées sur milieu M&S et M&S supplémenté en carnitine (5mM) après 7 jours de développement (le cercle rouge indique les plantules dont le développement est arrêté).

Que les plantules issues de graines provenant de plantes de génotype THA2-1/tha2-1 ou

THA2-2/tha2-2 soient cultivées sur M&S ou M&S supplémenté en carnitine, 23 à 26 %

d’entre elles sont arrêtées au stade dicotylédonaire. La carnitine ne semble donc pas avoir d’effet favorable sur le développement post-germinatif des mutants tha2 homozygotes lorsqu’elle est ajoutée au milieu de culture.

2.2.2 Dosage de la carnitine chez les mutants tha2-1 et tha2-2

Dans la mesure où le phénotype des plantules homozygotes pour les insertions d’ADN-T dans le gène THA2 est facilement identifiable, une expérience de dosage de la carnitine a été réalisée. Des graines issues de plantes hétérozygotes ont donc été semées sur du milieu de croissance M&S. Après 72 h, les plantules ayant arrêté leur développement (homozygotes

tha2-1/tha2-1, tha2-2/tha2-2) et les plantules présentant un développement normal

(tha2-1/THA2-1, THA2-1/THA2-1 et tha2-2/THA2-2, THA2-2/THA2-2) ont été récoltées séparément. Un comptage a permis de vérifier le ratio 25/75 de plantules homozygotes par rapport aux plantules hétérozygotes et sauvages sur le critère d’arrêt de développement. Une

extraction de la carnitine libre a été réalisée et quantifiée par spectrométrie de masse (Tableau 20).

Tableau 20: Teneur en carnitine de plantules issues de plantes hétérozygotes THA2-1/tha2-1 et

THA2-2/tha2-2 après 72 h de culture sur milieu M&S.

Col-0 THA2-1/tha2-1 THA2-1/THA2-1 tha2-1/tha2-1 THA2-2/tha2-2 THA2-2/THA2-2 tha2-2/tha2-2 Carnitine ng.mg^-1 MS 0,21 0,48 1,07 0,18 1,01

Les résultats montrent que la teneur en carnitine libre est plus élevée (plus de 1 ng.mg MS^-1) chez les plantules homozygotes pour les insertions d’ADN-T dans le gène THA2 que les plantules de génotype hétérozygote ou sauvage. Une répétition biologique indépendante de cette expérimentation a confirmé ce résultat.

La faible quantité de matériel biologique obtenue n’a pas permis de quantifier également la γ-butyrobétaïne chez les mutants tha2-1 et tha2-2.

2.3 Conclusion

Le mutant faible tha1-1 ne présente pas de diminution significative de la teneur en γ-BB et en carnitine libre ou totale.

Concernant la protéine THA2, deux mutants perte de fonction de THA2 ont été analysés. Un apport exogène de carnitine dans le milieu de culture utilisé pour la germination et le développement des graines ne permet pas de restaurer la viabilité des plantules homozygotes pour les mutations dans le gène THA2. D’autre part, une analyse de la carnitine contenue dans des plantules homozygotes montre que sa teneur y est plus de quatre fois plus élevée que dans des plantules sauvages.