1. Historique des techniques d’analyse génétique pangénomique
En cinquante ans, depuis la découverte du nombre exact des chromosomes chez l’homme en 1956, les techniques d’analyse globale du génome, ou pangénomique, ont beaucoup évolué, allant du caryotype standard d’une résolution de 5 à 10 Mb à l’analyse chromosomique sur puce ADN ou ACPA et enfin au séquençage de l’ADN de nouvelle génération ou NGS (Next Generation Sequencing) portant sur le génome entier (WGS : Whole Genome Sequencing). La technique d’hybridation in situ fluorescente, ou FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), est, quant à elle, d’une grande sensibilité mais représente une approche ciblée sur une zone particulière du génome définie par la nature des sondes utilisées (Hugon, 2010). Elle reste cependant d’une aide précieuse pour vérifier les résultats obtenus par des techniques moléculaires (ACPA ou NGS) car elle donne des renseignements sur la localisation exacte des anomalies dépistées, notamment pour ce qui concerne les duplications de segments génomiques (duplications en tandem ou insertion dans un autre chromosome).
2. Technique de cytogénétique conventionnelle (caryotype) Un caryotype standard sur lymphocytes sanguins en métaphase était réalisé en première intention. Pour cette étude, deux millilitres de sang hépariné ont été mis en culture à 37°C dans un milieu de culture Gibco Medium 199 (Invitrogen, Villebon-sur-Yvette, France) enrichi en glutamine et comportant un agent mitogène (phytohémaglutinine), de la pénicilline/streptomycine et 20% de sérum de veau fœtal sous
88 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après culture, les cellules ont été plongées dans une solution hypotonique faite d’une solution de chlorure de potassium suivi d’une étape de fixation dans un mélange de méthanol et d’acide acétique (3:1).
Après étalement des chromosomes sur des lames de microscope, des techniques de marquage en bandes suivies d’une coloration au Giemsa ont été réalisées
par dénaturation thermique ménagée pour obtenir un caryotype en bandes R (RHG-banding : R-bands by heating using Giemsa) et par digestion enzymatique par la
trypsine pour obtenir un marquage des chromosomes en bandes G (GTG-banding : G-bands by trypsin using Giemsa) selon les recommandations de l’ACLF
(Association des Cytogénéticiens de Langue Française) (ATC, 2000). Les chromosomes ont été ensuite observés sur des microscopes à lumière blanche équipés d’un système d’analyse d’images (Genikon) puis classés selon la nomenclature internationale de l’ISCN (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature), en fonction de leur taille, de leur indice centromérique et de leur morphologie (composition en bandes).
3. Analyse chromosomique sur puce ADN (ACPA)
L’ACPA repose sur le principe général de la CGH à la seule différence que la révélation de la technique s’effectue sur une puce ADN, support physique sur lequel sont fixés de très nombreux marqueurs, chacun spécifique d’une région chromosomique donnée. Cette technique permet de dépister des anomalies de nombre de copies dans l’ADN ou CNV (Copy Number Variants) avec une résolution de quelques milliers de paires de bases, contre plusieurs millions pour le caryotype classique.
Après avoir cohybridé en quantités égales un ADN témoin et l'ADN du patient marqués préalablement par des fluorochromes différents (respectivement vert et rouge) pendant 16 heures sur la puce, un scanner laser automatisé va lire les signaux et analyser informatiquement les données à l'aide d'un logiciel enregistrant l'intensité de fluorescence de l'ADN marqué par fluorochrome. Un profil de CGH où chaque point représente le ratio des signaux émis par le fluorochrome 1 et le fluorochrome 2 est obtenu. Toute déviation de la fluorescence vers le vert ou vers le rouge signera une perte de l’équiprobabilité d’hybridation des deux ADNs et donc une variation du nombre de copies dans l’ADN du patient.
89 Pour assurer un contrôle interne, une étude en « dye-swap » en inversant les fluorochromes permet d’obtenir une image en miroir signant la réalité des anomalies détectées. Une étude en trio des patients en comparant leur ADN à celui de leurs parents ou à d’autres patients n’ayant pas le même phénotype est l’autre moyen de contrôler la qualité de la CGH-array.
La caractéristique des techniques d’ACPA effectuées dans notre travail a été d’utiliser un type particulier de puces ADN, les puces « Single Nucleotide Polymorphism » ou puces-SNP (Andrieux, 2008) : les SNPs, pour polymorphismes nucléotidiques uniques, sont des variations d’une seule paire de base entre individus. Elles sont très fréquentes puisqu’il en existe plusieurs millions dans le génome humain. La modification d’une paire de base apparaît environ toutes les 800 paires de bases. L'analyse sur puce SNP, outre la détection de déséquilibres génomiques, permet de déterminer le génotype des patients offrant ainsi une analyse quantitative et qualitative du génome. La puce utilisée a été la puce SNP Illumina Cytochip 300K (Illumina Inc., San Diego, CA, USA), techniquée au sein du Plateau technique mutualisé de Génétique constitutionnelle du GHU Est (Coordinateur Pr. J.-P. Siffroi) et dont le principe est détaillé dans l’Annexe 5(Illumina Inc.; Keren, 2008).
Deux cents nanogrammes d’ADN extraits des lymphocytes sanguins ont d’abord été amplifiés (amplification enzymatique isothermique pangénomique à 37°C pendant 20 à 24 heures), fragmentés enzymatiquement à 37°C pendant une heure, dénaturés et déposés sur la puce pour une hybridation à 48°C pendant 16 à 24 heures. Au niveau de chaque sonde oligonucléotidique s’hybride un fragment issu de l’ADN génomique de l’échantillon étudié. Cette hybridation se fait de façon à ce que le premier nucléotide libre (non hybridé) du fragment soit le SNP. Chaque sonde oligonucléotidique subit une extension d’une seule base en se servant de la sonde comme amorce et du fragment hybridé comme matrice. Cette extension se fait par un ddNTP marqué juste au niveau du SNP lui-même. La puce est ensuite lavée de façon à déshybrider les fragments issus de l’échantillon, puis chaque SNP subit une amplification du signal à l’aide d’anticorps. Chaque SNP va donc renvoyer un signal fluorescent (rouge ou vert si homozygote, jaune si hétérozygote), dont l’intensité varie en fonction du nombre de copies.
90 L’analyse est ensuite réalisée sur le logiciel GenomeStudio V2010.3 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) utilisant à la fois le Log R ratio et le B allele frequency (Figure 16) :
- Le paramètre Log R ratio correspond à l’intensité du signal par rapport à la référence interne suivant la formule ln(R test/R référence). Un nombre de copies normal sera à ln1 soit 0, une délétion sera à ln0,5 soit -0,69, une duplication sera à ln1,5 soit 0,4.
- le paramètre B allele frequency correspond à la fréquence de B et donc le génotype de chaque SNP. Un SNP A/A sera à 0, un A/B sera à 0,5, un B/B sera à 1. En cas de délétion, il y a perte d’hétérozygotie ou LOH (Loss Of Heterozygosity) et l’absence de SNP A/B à 0,5. En cas de duplication, les SNP A/B à 0,5 disparaissent également, mais apparaissent des SNPs à 0,33 correspondant aux A/A/B et à 0,67 correspondant aux A/B/B. La qualité est donnée par un taux noté call rate supérieur à 0,99.
Figure 16. Représentation schématique des génotypes observés en cas de délétion ou duplication de deux SNP de type A/A et A/B.
Les variations du nombre de copies recensées sont comparées à la base de données de CNV : Database of Genomic Variants (DGV) (http://projects.tcag.ca/variation/).
91 4. Interprétation des données d’ACPA
Les CNVs sont définis comme une séquence d’ADN de 1 Kb ou plus, présente en un nombre variable de copies par rapport à un génome de référence, réparties en trois groupes : les CNVs pathologiques, les CNVs bénins considérés comme des polymorphismes nommés CNPs (Copy Number Polymorphism) et les CNVs dont les conséquences cliniques ne sont pas connues ou VOUS (Variant Of Unknown Significance). Des bases de données publiques répertorient les CNVs, parmi lesquelles la DGV qui répertorie les CNVs polymorphes ou CNPs. L’utilisation de cette base permet donc d’éliminer les CNV considérées comme non pathogènes.
La base de données DECIPHER (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources) a été utilisée quant à elle pour identifier des CNVs déjà rapportés chez des sujets présentant un phénotype particulier.
Les puces SNP permettant de génotyper les patients, elles présentent l’énorme avantage par rapport aux puces classiques de mettre en évidence des régions d’homozygotie ou ROH (Regions Of Homozygosity), traduisant par exemple une consanguinité parfois non connue, et des disomies uniparentales. Les régions de ROHs ont donc été recherchées avec beaucoup d’attention car pouvant révéler des mutations à transmission récessive dans des gènes d’intérêt : l'ensemble des gènes présents dans ces régions a donc été défini à l'aide de l'outil Genomic Oligoarray and SNP array evaluation tool v3.0 (http://firefly.ccs.miami.edu/cgi-bin/ROH/ROH_analysis_tool.cgi). Le résumé de la fonction de chaque gène a été répertorié à l'aide de l'outil GeneAlaCart (https://genealacart.genecards.org/Query) utilisant Entrez Gene Summary et UniProtKB Summary. La recherche de gènes d'intérêt a ensuite été faite par l'utilisation de mots clés: "Testis" et "Genital".
92