Etude des modifications post-traductionnelles de HIC1.

L’objectif de ce projet est de localiser précisément certaines modifications post- traductionnelles telles que la phosphorylation, l’acétylation et la O-GlcNAc du facteur de transcription suppresseur de tumeur, HIC1. Nous rechercherons l’impact de ces modifications sur les mécanismes de répression transcriptionnelle de HIC1 et sur l’interaction avec ces partenaires.

Ce projet se compose de quatre parties faisant appel à des techniques et des savoir-faire très différents : techniques de biochimie pour la production et la purification protéique, approche protéomique (électrophorèse 1D et 2D, spectrométrie de masse) et techniques de biologie moléculaire pour la construction de mutants et l’expression de protéines par transfection.

10.1-Identification des sites de phosphorylation, d’acétylation et de O-GlcNAc majeurs de HIC1.

Le premier travail réalisé dans ce projet sera de localiser précisément les sites de phosphorylation, d’acétylation et de O-N-acétylglucosaminylation de HIC1.

Nous avons récemment développé au laboratoire avec Marie-Christine Slomianny, une technique de « mapping »/localisation des sites de modifications post-traductionnelles en faisant intervenir la technologie HPLC (High Performance Liquid Chromatography). La protéine étudiée peut être d’origine endogène, si la quantité synthétisée par la cellule est suffisante pour la détection, ou cette protéine peut être produite par la cellule après transfection d’un vecteur l’exprimant.

Le principe de cette approche est le suivant : des cellules (Cos-7 ou HeLa) sont cultivées en présence d’un précurseur radioactif permettant de modifier post-traductionnellement la protéine d’intérêt. Ce précurseur diffère en fonction de la modification étudiée : il s’agit de [3H]-Glucosamine pour la O-GlcNAc, d’ [33P]-orthophosphate pour la phosphorylation et d’ [14C]-acétylCoA pour l’acétylation. La protéine étudiée est ensuite purifiée de l’extrait cellulaire. Cette purification est facilitée si la protéine est étiquetée à l’aide d’un court peptide ; dans ce cas celle-ci doit être transfectée. C’est le cas de HIC1 qui a été étiquetée en N-terminal par un octaptide du type « Flag » permettant une chromatographie d’affinité sur

un anticorps immobilisé (M2) sur billes de sépharose. Alternativement, pour la localisation des sites O-GlcNAc, un marquage peut être réalisé in vitro, après purification de la protéine d’intérêt, sur des résidus de O-GlcNAc par la galactosyltranférase bovine. Cette enzyme permet de greffer un résidu de galactose tritié sur les résidus de O-GlcNAc via l’UDP- [3H]Galactose, le donneur de sucre. On obtient ainsi un disaccharide radiomarqué. La protéine est ensuite soumise à une électrophorèse du type SDS-PAGE, le gel est coloré (Coomassie ou nitrate d’argent), séché sous vide, et exposé à un film ou la révélation peut être effectuée par un Phosphorimager (Biorad). La bande d’intérêt est repérée, découpée et incubée avec de la trypsine toute la nuit. Les peptides de digestion sont extraits du gel et séparés par HPLC. Un comptage radioactif (scintillation du type bêta) est réalisé afin de repérer les peptides radiomarqués, le peptide « froid », cette fois-ci, de temps de rétention identique au peptide « chaud », est analysé par spectrométrie de masse du type MALDI-TOF afin d’en connaître la masse précise. Ceci permet à partir de la séquence primaire de localiser finement les sites de modifications post-traductionnelles. Cette technique a été mise en place au laboratoire sur l’alpha-cristalline A, protéine dont le site de glycosylation (sérine 162) est connu (Roquemore et al., 1992). Nous avons grâce à cette technique, retrouvé ce site sans difficulté (Fig. 15).

Figure 15- Localisation du site de O-N-acétylglucosaminylation de l’alpha-cristalline A

L’alpha-cristalline a été marquée par l’ajout d’un résidu de galactose tritié in vitro sur les résidus de O-GlcNAc. Après digestion trypsique, les peptides sont séparés par HPLC (A) et les fractions radioactives sont repérées par comptage à scintillation. La masse du même peptide, mais marqué cette fois-ci par du galactose froid, est alors mesurée par spectrométrie de masse du type MALDI-TOF permettant son identification (B).

10.2- Impact fonctionnel des mutants de modification post-traductionnelle de HIC1.

Lorsque les sites de modifications post-traductionnelles majeurs de HIC1 auront été localisés, nous réaliserons des constructions de HIC1 muté sur certains acides aminés porteurs de ces modifications post-traductionnelles. Ceci sera réalisé grâce à la technique de mutagénèse dirigée par double PCR.

10.2.1- Rôle des modifications post-traductionnelles sur les interactions protéiques entre HIC1 et ses partenaires.

Cette partie sera centrée sur l’influence des modifications post-traductionnelles de HIC1 sur les interactions de celui-ci avec ses partenaires protéiques. Ce type d’analyse est actuellement développée dans le groupe de Dominique LEPRINCE et concerne notamment le rôle de l’acétylation et de la SUMOylation (travail de thèse de Nicolas STANKOVIC- VALENTIN). Nous proposons donc d’étendre cette étude au rôle de la phosphorylation et de la O-GlcNAc dans les interactions protéiques.

Différents facteurs interagissant avec HIC1 ont été identifiés. Le premier a avoir été mis en évidence est CtBP (C-terminal binding protein) (Deltour et al., 2002), un co-répresseur transcriptionnel, c’est à dire une protéine qui ne lie pas l’ADN mais qui interagit directement avec certains facteurs de transcription afin de réprimer la transcription. Nous proposons d’étudier l’influence des modifications post-traductionnelles sur l’interaction CtBP-HIC1. Pour cela, deux stratégies expérimentales pourront être envisagées. La première stratégie fait appel à la technique de co-immunoprécipitation ; la deuxième stratégie fait appel à la technique du double-hybride en cellule mammifère. Dans cette technique, un des partenaires est produit sous la forme d’une protéine chimère avec le domaine de liaison à l’ADN de Gal4, le second partenaire, sous la forme d’une protéine chimère avec le domaine d’activation de la transcription de VP16 (voir exemple en Fig. 8). De cette manière, si les deux partenaires

interagissent, le rapprochement spatial du domaine transactivateur et du domaine de liaison à l’ADN « re-crée » un facteur de transcription qui induit la transcription d’un gène rapporteur (la luciférase) placé sous le contrôle d’éléments de réponse à Gal4.

Récemment, Nicolas STANKOVIC-VALENTIN a isolé un nouveau partenaire de HIC1, Hsp60 ou chaperonine, en l’immunoprécipitant avec la protéine HIC1 endogène. L’identification d’Hsp60 a été effectuée par analyse protéomique (Marie-Christine SLOMIANNY) puis confirmée par western blot à l’aide d’un anticorps anti-Hsp60. L’expérience inverse a été réalisée par transfection d’un vecteur exprimant Flag-HIC1 (pcDNA3-Flag-HIC1) et par co-immunoprécipitation du lysat cellulaire avec l’anticorps anti- Hsp60 (Fig. 16 A). Pour aller plus loin, nous avons incubé de la N-acétylglucosamine lors de l’étape de co-immunoprécipitation de HIC1 et des lavages des billes de protéine G. Cette expérience nous a révélé que l’interaction HIC1-Hsp60 semblait être O-GlcNAc-dépendante (Fig. 16A). Nous avons pu également mettre en évidence l’activité lectinique de Hsp60 (Fig. 16B). Notons que Hsp60 a été très récemment décrite comme porteur de motifs O-GlcNAc (Kim et al., 2006). L’importance biologique de l’interaction physique HIC1-Hsp60 reste à démontrer. Un manuscrit sur ces résultats sera prochainement rédigé (STANKOVIC- VALENTIN, GUINEZ et al.).

Fig. 16- HIC1 et Hsp60 interagissent de manière O-GlcNAc-dépendante

Des cellules HeLa ont été transfectées avec un vecteur exprimant la protéine HIC1 « flaggée » sur sa partie N- terminale (48h). Après lyse des cellules dans un tampon doux, des co-immunoprécipitations ont été effectuées

avec un anticorps anti-Hsp60 en présence (+) ou en absence (-) de N-acétylglucosamine (GlcNAc). Les immunoprécipités ont été soumis à une électrophorèse en mode SDS-PAGE, transférés sur membrane de nitrocellulose, puis une révélation a été réalisée avec un anticorps dirigé contre le peptide Flag ou avec un anti- Hsp60 (A). L’activité lectinique d’Hsp60 a été mise en évidence par enrichissement de celle-ci sur billes couplées à la GlcNAc (B). Hsp70 nous a servis de témoin positif, et la bêta-caténine de témoin de charge. L’expérience a été effectuée à 37°C (Ctrl) et à 42°C (HS, heat shock).

10.2.2- Rôle des modifications post-traductionnelles sur la répression transcriptionnelle de HIC1.

La dernière partie de ce projet sera consacrée à l’influence des modifications post- traductionnelles sur l’activité transcriptionnelle de HIC1. Pour cela les mutants de modifications post-traductionnelles seront étudiés sur la capacité qu’aura HIC1 à inhiber la transcription d’un gène rapporteur placé en aval d’un concatémère de 5 sites consensus de liaison à l’ADN de HIC1 (Pinte et al., 2004).