Etude de la O-N-acétylglucosaminylation du suppresseur de tumeurs HIC1 (Article X).

Au cours de mon stage post-doctoral effectué de février 2002 à août 2003, à l’Institut de Biologie de Lille (IBL), au sein de l’UMR 8526 dirigée par le Pr. Dominique STEHELIN et dans le groupe du Dr. Dominique LEPRINCE, je me suis plus particulièrement intéressé à l’étude de HIC1 (Hypermethylated in cancer 1), facteur suppresseur de tumeurs impliqué dans plusieurs déficiences tel que le syndrome de Miller-Diecker (Carter et al., 2000) et la tumorisation des tissus (Chen et al., 2003). Mon travail a été centré sur la glycosylation de HIC1, d’une part, et sur la mise en évidence de la protéine endogène HIC1, d’autre part. Cette deuxième partie ne sera pas discutée dans ce mémoire.

HIC1 tire son nom du fait qu’on retrouve le gène codant cette protéine, HIC1, dans la région 13.3 du bras court du chromosome 17 (Wales et al., 1995), région fréquemment hyperméthylée ou délétée dans bon nombre de cancers. Le fait que le gène HIC1 soit dans une région fortement méthylée (îlots CpG) explique pourquoi celui-ci est très peu exprimé puisque la méthylation de régions promotrices favorise la répression de l’expression génique (« gene silencing ») (Baylin & Herman, 2001 ; Herman & Baylin, 2003) : elle peut concerner des gènes codant des suppresseurs de tumeurs et favoriser ainsi le déroulement des processus de cancérisation.

HIC1 est une protéine de 714 acides aminés qui présente trois domaines fonctionnels. Le premier domaine, situé dans la région N-terminale, est en fait un domaine BTB-POZ de 120

acides aminés. Ce type de domaine est connu pour sa capacité à se dimériser et à réguler certaines interactions protéiques. C’est également un domaine autonome de répression transcriptionnelle. La région centrale de HIC1 est peu conservée entre les espèces mais celle- ci possède par contre un motif conservé du type GLDLSKK proche de la séquence PxDLSxK permettant le recrutement du co-represseur CtBP (Deltour et al., 2002). Enfin la région C- terminale de HIC1 possède cinq doigts de zinc du type Krüppel (C2H2) permettant la reconnaissance nucléotidique, et une extrémité sans domaine fonctionnel apparent mais qui est, par contre, très conservée.

Notre premier travail sur HIC1 a d’abord été de mettre en évidence l’existence de la O- GlcNAc. Pour cela différents systèmes cellulaires ou d’expression ont été utilisés, ainsi que plusieurs outils de mise en évidence de cette glycosylation. Nous avons ainsi pu mettre en évidence la O-GlcNAc sur HIC1 par traduction de celui-ci dans un lysat de réticulocyte (construction pcDNA3-FlagHIC1), soit par enrichissement des formes glycosylées sur billes couplées à la WGA (Article X, Fig.1A), ou par immunoprécipitation avec un anticorps anti-

O-GlcNAc (RL2) (Article X, Fig. 1B). La glycosylation a pu également être détectée dans une

lignée de cellules CHO exprimant de manière stable HIC1 (Article X, Fig.1C). Enfin des transfections transitoires dans des cellules Cos-7 ont permis, d’une part, d’utiliser l’anticorps anti-O-GlcNAc par immunoprécipitation (Article X, Fig.1D), d’autre part, d’enrichir les formes glycosylées sur WGA immobilisée ou de prévenir cet enrichissement par traitement préalable par la bêta-hexosaminidase (Article X, Fig.1E). Enfin, cela nous a permis de confirmer définitivement la présence de cette modification post-traductionnelle par transfert de galactose tritié sur les résidus de GlcNAc (Article X, Fig.1E). Ce résultat nous était apparu très important puisque HIC1 n’était que le second facteur suppresseur de tumeurs à avoir été démontré comme modifié par la O-GlcNAc, le premier étant p53 (Shaw et al., 1996).

Des enrichissements en protéine HIC1 (facilités par la présence d’une séquence « Flag » en position N-terminale) marquée au galactose tritié, suivi d’une hydrolyse trypsique, a montré que HIC1 était modifié par la O-GlcNAc au moins sur trois sites (Article X, Fig.2). L’identification de ces sites fait l’objet en partie de notre projet (paragraphe 10).

Connaissant un des partenaires de HIC1, CtBP, et sachant que la O-GlcNAc est un des produits finaux de la voie de biosynthèse des hexosamines, nous avons voulu savoir si l’interaction HIC1-CtBP pouvait être sous l’influence de la glycosylation de HIC1. Pour cela des cellules Cos-7 exprimant transitoirement HIC1 dépourvu de domaine BTB-POZ ont été cultivées en présence de glucosamine de sorte à augmenter « artificiellement » le niveau de O-

GlcNAc de HIC1 (Article X, Fig.3). Des expériences de double hybride mammifère effectuées dans ces conditions ont démontré que l’interaction entre les deux partenaires ne semblait pas sous l’influence de la glycosylation de HIC1 puisqu’en présence de glucosamine cette interaction n’était pas modifiée (Fig. 8). Le rôle de cette glycosylation était donc à rechercher ailleurs, soit dans la modulation d’une interaction avec un autre partenaire, soit dans une toute autre fonction.

Des constructions HIC1ΔPOZ-Gal4 et CtBP-VP16 ont été utilisées pour évaluer l’influence de la O-GlcNAc de HIC1 sur l’interaction avec CtBP (Fig. 8A). Les expériences ont été réalisées en absence (Ctrl) ou en présence de glucosamine à 20 mM, de sorte à augmenter le niveau de glycosylation de HIC1 (Fig. 8B). La mesure de l’activité luciférase a été effectuée par luminométrie.

L’utilisation de mutants de délétions, nous a permis de localiser « grossièrement » les sites de

O-GlcNAc (Article X, Fig. 4) dans le domaine de liaison de l’ADN (DBD) de HIC1 (entre les

résidus 400 et 616). Nous avons donc voulu vérifier l’hypothèse selon laquelle la glycosylation de HIC1 dans le DBD peut influer sur la reconnaissance oligonucléotidique. HIC1 a donc été produit par traduction in vitro en utilisant le système du lysat de réticulocyte. Les protéines HIC1 glycosylées et non-glycosylées ont été fractionnées par enrichissement sur WGA immobilisée (Article X, Fig. 5A). Chacune des fractions a alors été testée en « gel- shift », ou EMSA, pour sa capacité à lier l’ADN (Article X, Fig. 5B). Contre toute attente nous n’avons pas vu de différence de fixation entre les formes glycosylées de HIC1 et celles non-glycosylées. Par contre des complexes de petite taille mettant en jeu des formes tronquées de HIC1 dans la région N-terminale permettent d’observer un différentiel dans la fixation de la sonde oligonucléotidique par ces formes : les formes tronquées et glycosylées de HIC1 ne sont pas capables de fixer la sonde. Nous avons donc supposé que la glycosylation des formes tronquées de HIC1 n’était pas localisée au même endroit de la protéine que sur la forme de pleine longueur. En suivant la même stratégie que pour la protéine de pleine longueur, des mutants de délétion ont permis de localiser la O-GlcNAc de la forme tronquée de HIC1 dans une séquence située entre les acides aminés 339 et 669 (Article X, Fig. 6). De nouvelles expériences de « gel-shift » sont venues confirmer que la forme glycosylée de HIC1 tronquée ne se fixait pas l’ADN (Article X, Fig. 7).

L’utilisation d’anticorps anti-phosphosérine, anti-phosphothréonine et anti-phosphotyrosine sur les différentes constructions de HIC1 a permis de localiser « grossièrement » certains sites de phosphorylation en plus des sites O-GlcNAc (Fig. 9).

Figure 9- Localisation « grossière » des sites de O-N-acétylglucosaminylation et de phosphorylation de HIC1.

La figure 10 présente la glycosylation de HIC1 sur les deux formes de HIC1, longue et tronquée, et propose que les gènes cibles des deux formes puissent être, d’une part, de nature différente et que l’effet de la glycosylation puisse, d’autre part, influencer la fixation sur la cible nucléotidique. Si l’on considère comme indiqué dans la figure 5, que l’UDP-GlcNAc est sous l’influence directe de l’état nutritionnel de la cellule, alors la fixation à l’ADN de la forme de pleine longueur de HIC1 ne sera pas dépendante des conditions physiologiques modulant les niveaux de O-GlcNAc contrairement à la forme tronquée : plus le niveau de glycosylation de cette forme de HIC1 est élevé, moins cette forme se fixerait à l’ADN (Fig. 10).

Figure 10- Localisation des sites de O-GlcNAc sur les deux formes de HIC1 et l’influence de la glycosylation sur l’activité transcriptionnelle.