Etude des acteurs tardifs de la recombinaison homologue

III. Etude de l’impact de la réparation des DSB sur le génome de

Streptomycesambofaciens

Par la suite, ces résultats seront discutés dans une discussion générale et les

perspectives à apporter seront détaillées.

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CHAPITRE 2 :

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I. Etude des acteurs tardifs de la recombinaison homologue

Article N°1 : Accepté pour publication dans le journal Research in Microbiology le 04/07/16

Résumé des résultats de l’article :

Dans la partie introductive, le rôle et les caractéristiques des différentes protéines

intervenant dans la RH ont été décrits pour les trois bactéries modèles que sont E. coli, B.

subtilis et Mycobacterium. Chez les Streptomyces, si l’implication de RecA dans la RH a été

démontrée à plusieurs reprises (Vierling et al., 2001 ; Huang et al., 2006), l’identité des

acteurs intervenant dans les étapes précoces et tardives de la RH est longtemps restée

inconnue, faute d’études sur le sujet. Ainsi, après avoir démontré au laboratoire l’essentialité

du locus adnAB, qui pourrait être responsable du traitement des extrémités d’une DSB lors

de l’étape pré-synaptique de la RH (Zhang et al., 2014), nous nous sommes tout

naturellement penchés sur l’identification des acteurs de l’étape post-synaptique de la RH.

Chez E. coli et B. subtilis, le résolvasome RuvABC (RuvAB/RecU chez Bacillus) et l’hélicase

RecG sont connus pour jouer un rôle redondant dans l’étape post-synaptique de la RH

(Lloyd et Sharples, 1993 ; Whitby et al., 1993 ; Sanchez et al., 2005). Tandis que RuvAB et

RecG catalysent la migration des JH, l’endonuclease RuvC/RecU permet de cliver la structure

à quatre brins et de restaurer la conformation double-brin (Connolly et al., 1991 ; Müller et

West, 1994 ; Ayora et al., 2004). Ainsi, chez E. coli, la délétion de ruvABC ou recG n’impacte

que peu les cellules dans la résistance aux dommages de l’ADN, tandis qu’un mutant

∆ruvABC ∆recG y est très sensible (Lloyd et Buckman, 1991). Chez B. subtilis la délétion

combinée de ruvAB, recU et recG n’est pas viable (Sanchez et al., 2005, 2007).

S’il est connu que les gènes ruvABC et recG sont présents chez Streptomyces (Rocha et al.,

2005), aucune information n’est disponible quant à leur conservation au sein des différentes

espèces. Ainsi, le premier travail de cette étude a été de rechercher la présence de ces gènes

dans les 38 génomes alors séquencés de Streptomyces. Nous avons pu constater que les deux

loci sont fortement conservés, chaque espèce possédant un orthologue de ruvABC et un

orthologue de recG. Afin de pouvoir étudier leur rôle et implication dans la RH, des souches

Implication of RuvABC and RecG in Homologous Recombination in

Streptomyces ambofaciens

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mutées pour ruvABC, pour recG mais également pour les deux loci ont été construites chez S.

ambofaciens ATCC 23877. De la même manière, une souche délétée du gène recA a

également été construite afin d’être utilisée dans toutes les expériences réalisées comme un

témoin déficient pour la RH. Afin de déterminer l’implication de ces gènes dans la RH, 3

approches ont été mises en œuvre.

Dans une première approche, les spores des différents mutants ont été exposées aux

rayons UV afin de tester la réponse de ces souches aux dommages de l’ADN. Les résultats

nous révèlent que les mutants ∆ruvABC et∆recG ne sont pas significativement plus sensibles

aux UV qu’une souche sauvage tandis qu’un double mutant ∆ruvABC ∆recG est deux fois plus

affecté que la souche sauvage. Toutefois, ces valeurs restent modestes en comparaison d’un

mutant ∆recA dont le taux de survie après exposition aux UV est 250 fois inférieur à celui de

la souche sauvage.

Les deux approches suivantes sont axées directement sur des mesures de taux de

recombinaison. Elles se distinguent toutefois par le fait que la première approche est basée

sur de la recombinaison conjugative, c’est-à-dire l’intégration d’un fragment d’ADN ou le

remplacement d’un locus après transfert d’ADN par conjugaison, tandis que la seconde est

basée sur de la recombinaison intra-chromosomique délétant un locus grâce à un évènement

de RH entre deux séquences homologues placées en répétition directe. L’approche de

recombinaison conjugative nous révèle ainsi que l’efficacité de recombinaison après

conjugaison diminue de 3 à 5 fois pour les mutants ∆ruvABC et ∆recG, tandis qu’elle est

encore aggravée pour un double mutant ∆ruvABC ∆recG, à savoir 10 à 15 fois inférieure à

celle d’une souche sauvage. Cependant, il est à noter que contrairement à ce qui se déroule

dans un contexte ∆recA où aucun recombinant n’a pu être obtenu, la RH est toujours

possible en absence de RuvABC et RecG. En revanche, il existe une différence majeure entre

recombinaison conjugative et recombinaison intra-chromosomique puisque pour cette

dernière, aucune différence significative n’a pu être constatée entre l’efficacité de

recombinaison obtenue pour le mutant ∆ruvABC ∆recG et la souche sauvage.

Ces résultats nous apportent des informations précieuses sur l’importance de

RuvABC et RecG lors de l’étape post-synaptique de la RH chez les Streptomyces. En effet,

comparés à l’impact qu’entraine la délétion de ces mêmes acteurs chez d’autres bactéries

telles qu’E. coli et B. subtilis, les résultats obtenus chez S. ambofaciens suggèrent que des

protéines alternatives seraient également capables d’assurer cette fonction. La différence

qui existe entre l’approche conjugative et intra-chromosomique permet également de

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supposer que la présence d’ADN exogène pourrait avoir un impact sur l’expression de ces

gènes et ainsi favoriser leur intervention plutôt que celle de protéines alternatives.

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