L’analyse des clones Kan S révèle des cicatrices typiques d’une réparation NHEJ

Afin de confirmer l’existence d’un mécanisme de NHEJ responsable d’évènements de

réparation mutagène, la séquence nucléotidique de la région entourant la cassette IKI a été

précisément analysée dans les clones Kan

. Pour cela, différents couples d’amorces ont été

testés pour obtenir un amplifiat dont le séquençage révèlerait la cicatrice de la réparation au

locus IKI-C. Etant donné la présence du gène de résistance à l’hygromycine (utilisé pour

maintenir la pression de sélection sur le plasmide pMS82), directement en amont de la

cassette IKI, les clones ayant subi des délétions dans la partie 5’ de la cassette ont été

contre-sélectionnés, et seules deux amorces « 5’ » situées respectivement 100 et 1000 pb en amont

de la cassette ont été nécessaires (figure R5). En revanche, aucun gène connu pour être

essentiel n’a été détecté directement en aval de la cassette IKI, et des amorces « 3’ » ont été

dessinées tous les kilobases sur une longueur totale de 20 kb en aval de la cassette (figure

R5).

Figure R5 : Environnement génétique du locus de DSB ciblée IKI-C de la région centrale du

chromosome. Le plasmide pMS82, intégré au site d’attachement du phage φBT1 en position 4,94

Mb, porte la cassette IKI, composée du gène neo qui code la résistance à la kanamycine, flanqué

de deux sites I-SceI convergents (en rouge), un gène de résistance à l’hygromycine (hyg

) et le

gène int codant pour l’intégrase site-spécifique (en jaune), ainsi qu’une origine de transfert par

conjugaison (oriT). Les ORF du chromosome de S. ambofaciens voisines d’IKI-C sont indiquées

en bleu. Les amorces utilisées pour séquencer les cicatrices de réparation post-DSB sont

représentées par des triangles bleus. Deux amorces « 5’ » ont été dessinées en amont de la

cassette IKI ainsi qu’un panel d’amorces « 3 » positionnées approximativement tous les kilobases

en aval de la cassette sur une longueur totale de 20 kb jusqu’au gène SAM23877_4683.

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L’amplifiat obtenu pour chaque clone Kan

a été séquencé et les cicatrices de

réparation ont été analysées en comparant la séquence obtenue avec celle du génome de

S. ambofaciens ATCC 23877 (Thibessard et al., 2015). Au total, 64 séquences de clones Kan

ont pu être obtenues pour l’ensemble des lignées du contexte sauvage. Le bilan des

caractéristiques des séquences de réparation ainsi que certains exemples représentatifs des

cicatrices observées sont présentés respectivement dans les figures R6 et R7.

Figure R6 : Caractéristiques des évènements de réparation survenus dans les clones Kan

. A)

Taille et occurrence des microhomologies B) Taille et occurrence des délétions C) Nature de

l’intervention de la polymérase pour l’ajout de nucléotides.

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Figure R7 : Exemples caractéristiques de cicatrices de NHEJ obtenues au locus IKI-C. La colonne de gauche représente les délétions (échelle en kb) observées

pour les différents évènements de réparation. La cassette IKI est représentée en rouge et les sites I-SceI sont représentés par un trait vertical. La colonne de droite

représente la séquence des cicatrices de réparation correspondant aux évènements de la colonne de gauche. La séquence du haut représente la cassette IKI après

restriction par la méganucléase I-SceI mais avant réparation. Etant donné que le site I-SceI est non palindromique, les extrémités générées par la restriction sont

représentées de deux couleurs différentes (rouge et bleu). Le symbole ∆ indique le nombre de nucléotides perdus. ∆neo indique une perte du gène de résistance à la

kanamycine. Les nucléotides ajoutés en absence de matrice sont représenté en vert, tandis que les nucléotides synthétisés pour combler des lacunes simple-brin

(fill-in) sont représentés en orange. Les nucléotides intervenant dans la formation de microhomologies sont soulignés.

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Pour l’ensemble des séquences analysées, des délétions affectant la cassette IKI ont

systématiquement été observées. A l’exception de deux clones pour lesquels la perte de

respectivement 180 et 598 nucléotides au sein du gène de résistance à la kanamycine

semble indépendante de la restriction d’I-SceI (les deux sites sont intacts, figure R7, ev. 3),

tous les évènements de réparation incluent une modification d’un site (25/62) ou des deux

(37/62) sites I-SceI. Dans la majorité des cas, la résection des extrémités de la cassure se fait

de manière bidirectionnelle c’est-à-dire que les deux extrémités de la cassure subissent une

délétion (55/62) et plus rarement, la résection des extrémités se fait uniquement de

manière unidirectionnelle (figure R7, ev. 1). La taille des délétions est variable : pour plus

d’un tiers (24/62), moins de 500 pb sont perdues (191 pb pour la délétion minimale

observée ; figure R7, ev. 1), tandis que pour 7 clones sur 62, plus de 10 kb ont été perdus

(23,6 kb pour la délétion la plus importante observée, soit 20 gènes ; figure R7 ev. 9). Pour

7 clones Kan

, aucune amplification PCR n’a été obtenue, suggérant que la délétion excède

23,6 kb.

Pour un peu plus de la moitié des cas (35/64), la cicatrisation de la cassure a été

favorisée par la présence de microhomologies résultant du traitement des extrémités. Dans

la majorité de ces 35 cas, la taille des microhomologies varie entre 1 et 3 nucléotides

(29/35 ; figure R7, ev. 7). Cependant, l’analyse de certaines séquences a révélé l’utilisation

de microhomologies dont la taille varie entre 4 et 6 nucléotides (6/35 ; figure R7, ev. 2et8).

Contrairement aux évènements de délétion, observés dans 100% des cas, l’addition de

nucléotides a été observée dans moins de la moitié des cas (26/64) Ceux-ci peuvent être

classés en deux catégories. Dans la première catégorie (8/26), un seul nucléotide a été

ajouté au niveau d’extrémités franches formées par une résection bidirectionelle (figure R7,

ev. 4). Dans la seconde catégorie (18/26), l’addition de 1 à 4 nucléotides se fait par « fill-in »,

c’est-à-dire par comblement de lacunes simple-brin générées lors de la réparation de la

cassure (figure R7, ev. 1, 5 et 9).

Il est intéressant de noter que certaines cicatrices de réparation ont été observées à

plusieurs reprises. C’est notamment le cas des évènements 5 et 6 de la figure R7, observés

respectivement 3 et 2 fois. Dans les deux cas, les deux sites I-SceI ont été coupés et la

cassette IKI a été perdue. Dans le cas de l’événement 5, un seul nucléotide a été délété des

extrémités 3’ sortantes, formant ainsi une microhomologie de 2 nucléotides. Avant la

ligation, la lacune simple-brin d’un nucléotide a été comblée par fill-in. Pour l’évènement 6,

les 4 nucléotides des extrémités 3’ sortantes ont été délétés et les extrémités franches ainsi

engendrées ont été liguées. La ligature d’extrémités incompatibles après traitement

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(résection, resynthèse) est une des caractéristiques du mécanisme de NHEJ tel qu’il a été

caractérisé chez M. tuberculosis (Stephanou et al., 2007 ; Aniukwu et al., 2008 ; Gupta et al.,

2011).